检验科微生物实验室作业指导书和相关制度

1、检验科微生物实验室作业指导书和相关制度检验科微生物实验室SO项件细菌室工作守则1. 每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。2. 入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。3. 实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。4. 非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。6. 标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。7. 实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10 分，再用

2、肥皂洗手并冲洗干净; 如误入口内，应立即吐出，并用1:1000 高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。8. 实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗; 如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。9. 若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（ 如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等） 必须远离火源，妥善保存。10. 工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。11. 离室前工

3、作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。12. 爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。细菌室消毒隔离措施1. 每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒。2. 非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。3. 使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。 4. 试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡（ 至少 24 小时以上 ） 后清洗或丢弃。5. 所有微生物培养物（ 细菌、支原体、真菌等培养物） ，不管标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。6.

4、取材、最好采用一次性工具，不能采用一次性工具者，每次取材前均应彻底消毒。 7. 用于浸泡各种器械如刮菌刀、持物钳、镊子等的消毒液要定期更换。8. 不慎发生临床标本或培养物污染工作台，不要立即用水冲洗，应先用纸巾、布等敷料加上消毒液（ 如 5%石炭酸、3%来苏儿等） 消毒 30 分钟以上，然后再清洗。如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。9. 实验时手部污染，应立即用肥皂洗手并冲洗干净，再外用消毒药水，如误入口内，应立即吐出，并用1:1000 高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，必要时根据实际情况服用有关药物。检验科 微生物实验室安全与防护在工作区内禁止饮食，吸烟和存放食物及使用化妆品。实验室里应保持整

5、洁，不存放与工作无关的杂物。工作台每天至少用消毒剂清洁一次，在溢渗传染物后要立即消毒、清洗; 进入无菌室必须穿工作服，戴口罩、帽子。在各种操作进程中均应尽量避免或减少气溶胶产生。实验工作区禁止无关人员出入，尤其要严禁儿童进入。凡发工作人员在处理传染性物质或动物之后，以及在离开实验室时要洗手。生溢漏事故或接触传染性物质后，均应立即报告实验室监督员或实验室主任，并做好书面记录及采取相应措施。结核杆菌的培养及标本涂片务必在生物安全柜里操作。 9. 有涉及感染性材料的操作应在生物安全柜中进行，如结核杆菌培养、感染性组织等。10. 工作人员在进入实验室工作区前，应在专用的更衣室（ 或缓冲间）穿着背开式工

6、作服或其它防护服。工作完毕后必须脱下工作服，不得穿工作服离开实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。11. 工作时必须戴手套（ 两副为宜 ） 。一次性手套必须先消毒后丢弃。12. 在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于取用。可配备应急药品。细菌室内质控制度每位工作人员必须加强质控意识，以质量控制工作为核心，认真做好各项质控试验和记录。加强质量控制和专业理论知识的学习，规范操作，正确分析处理结果。 一旦发现失控，及时采取相应措施，纠正失控结果。每批自配或购置的培养基、生化鉴定等试剂必须用标准菌株ATCC2785、 3ATCC25923 ATCC2592须控。合格方可使用

7、，并作好记录。每周进行药敏试验质量控制。对每批微量药敏板、培养基、药敏纸片必须用ATCC27853 ATCC25923 ATCC25922g株进行质控，并做好记录，出现问题及时分析，采用相应措施。每天观察培养箱、CO邪养箱、冰箱的温度，并做好记录。无菌间每周监测一次，三氧机、紫外线消毒灭菌情况，并做好记录。每三个月用 ATCC27853 ATCC25923 ATCC25922g株对全自动微生物分析仪进行鉴定和药敏质量控制。认真讨论、分析每次参加卫生部室间质评结果。总结经验教训。临床微生物及实验室的医院感染管理检验科医院感染管理应达到以下要求工作人员必须穿工作服, 戴工作帽 , 必要时穿隔离衣，

8、胶鞋，戴口罩, 手套。 使用合格的一次性检验用品, 用后进行无害化处理。严格执行无菌技术操作规程, 静脉采血必须一人一针一管一巾一带; 微量采血应做到一人一针一管一片; 对每位病人操作前洗手或手消毒。无菌物品如棉签, 棉球 , 纱布等及其容器应在有效期内使用, 开启后使用时间不得超过 24 小时 . 使用后的废弃物品, 应及时进行无害化处理, 不得随意丢弃。各种器具应及时消毒, 清洗 ; 各种废弃标本应分类处理（ 焚烧, 入污水池, 消毒或灭菌 ） 。 报告单应消毒后发放。检验人员结束操作后应及时洗手, 毛巾专用, 每天消毒。保持室内清洁卫生. 每天对空气, 各种物表及地面进行常规消毒. 在进

9、行各种检验时 , 应避免污染; 在进行特殊传染病检验后, 应及时进行消毒, 遇有场地 , 工作服或体表污染时应及时处理, 防止扩散 , 并视污染情况向上级报告。菌种、毒种按传染病防治法进行管理。实验室的医院感染管理参照检验科的管理要求. 实验动物应严格管理, 防止逃逸或造成人与实验室动物的交叉感染; 实验后的动物必须焚化进行无害化处理。细菌鉴定和药敏试验操作按全国临床检验操作规程。负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。从事细菌专业技术人员，应了解医院监测知识，掌握其检测方法，定期统计分析医院感染细菌分布，耐药变迁，并将其结果反馈临床。细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、

10、灭菌知识。细菌专业人员不断更新知识，了解细菌学检验新进展。定期或随时与临床联系，主动参与病例讨论了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。每天发出的微生物报告应认真复审，分析报告、评价报告。工作人员加强有菌观念，无菌操作。当工作环境被细菌污染，必须立即消毒处理，报告主管人员，采取必要措施。10工作人员被细菌培养物污染应消毒处理，必要时给予药物治疗，并向主管负责人报告，采取特殊措施。无菌间规章制度每一个工作人员必须树立无菌观念，严格进行无菌操作。在无菌室内必须戴帽子、口罩，进行无菌操作。每天早上8:00 8:30 用紫外线消毒或在凌晨4-6 点用多功能机消毒2 小时，每月检查一次紫外灯的

11、无菌效果。无菌室内各种废弃物品必须煮沸消毒。实验完毕后，用含氯制剂1000mg/L消毒桌面、地面。菌 （ 毒种） 管理办法1. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全。保管人员变动时，必须严格交接手续。2、菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能 （ 包括形态、染色、抗原结构、动物致病力等） ，并注明使用、转移、销毁情况及原因。3、各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换。4、菌种保存范围及向外单位转移，应按国家卫生部规定执行。5、所有存在菌种应具备清单。细菌室仪器维护保养

12、及质控措施我室主要仪器为 BacT/Alert 120、BACTEC905血培养仪和 Vitek-32、BD凤凰全自动细菌鉴定和药敏分析仪，为了使仪器能够高质量的运行，使仪器报告的结果准确可靠，特制定以下仪器维护、保养和质控措施。一、BacT/Alert 120、BACTEC9050培养仪的维护、保养和质控措施 1.每天上班开始工作前和下班离开前要检查仪器的工作状态是否正常，仪器培养箱温度的报告里外是否一致。2. 每天用中性的清洁液将仪器表面擦拭干净3. 每天先做质控。4. 一个月至少做一次全程定标。5. 仪器检测数据每周星期六做备份。6. 仪器每一个月做一次彻底的清洁保养，包括清洁外壳、瓶孔

13、、滤网等7. 仪器每年请工程师做一次检定工作。二、Vitek-32、BD凤凰全自动细菌鉴定和药敏分析仪的维护、保养和质控措施1. 每天上班开始工作前和下班离开前要检查仪器的工作状态是否正常。2. 每天用中性的清洁液将仪器表面擦拭干净3. 购买的新批号的试剂都必须先做质控，质控合格后才能用于临床检测。4.仪器检测数据每周星期六做备份。5. 仪器每一个月做一次彻底的清洁保养，包括清洁外壳、卡片架、滤网等6.仪器每年请工程师做一次检定工作。标准菌株保存及使用概述 : 标准菌株是细菌室室内质控工作必不可少的、重要的生物资源，我室的标准菌株主要来自省临检中心的发放和从卫生部临检中心以及国家菌种保存中心购

14、买所得，为了让标准菌株能够得到合理的应用，特制定以下规定。1. 对每批购买的标准菌株要做好登记，包括菌种的菌名、编号、购买时间、保存地点、记录人等2. 每次使用标准品都应作好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。 3. 购买的标准品初次使用时，应大量增殖，然后分装在含10-15%甘油的胰蛋白胨肉汤中，-20?以下保存。4. 新的标准菌株复苏最多不得超过三次，如超过三次将不在视为标准菌株使用。 5. 标准菌株保存管一经溶化使用后，不得再次冻存。细菌室内务管理规定1. 细菌室岗位分工与职责管理规定1.1 概述鉴于细菌室工作琐碎烦杂且千头万绪，为了使细菌室的工作能够保质保量地顺利完成，特将细

15、菌室暂定为两个岗位，以明确工作范围、增强责任心、便于日常工作的完成。当然由于细菌室不同岗位工作量的随机性较大，故我室要求大家发扬既分工，又协作的精神，共同完成细菌室工作。1.2 岗位职责各岗位工作人员要求严格按照作业指导书进行操作，高质量的完成本岗位工作，如遇到问题须提出经讨论解决。1.3 岗位分工岗位 ?: 完成细菌培养标本（? 号菌培养除外） 的结果观察处理及报告发放。岗位 ?: 完成仪器的维护、保养和质控工作等。2. 细菌室记录内容明细2.1 环境条件室内温度、湿度，每天一次，上午记录。2.2 恒温设备2.3孵箱、普通冰箱，每天一次，上午记录。2.3 分析仪器常规每日保养一次，发现问题随

16、时详细记录; 质控按要求测试完毕后，及时手工记录，2.4 标本与结果不合格标本记录、危急值报告记录、结果记录。2.5 岗位记录 （附表 : 细菌室岗位记录表）2.6 其它记录，如交班记录等。3. 细菌室室内环境条件控制范围温度18,28?，湿度20,80, 。检验科作业指导书细菌室内务管理规定文件编号:LAB,SOP,JX011 第 2 页，共 2 页版本 :1生效日期:2005-11-01标本采集及保存要求1 总则 : 用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本应妥善保存。2 . 临床标本的采集2.1 下呼吸道分泌物（痰液 ）令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即

17、从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。2.2 尿液 （中段尿 ）护理人员协助采取中段尿约3ml 入无菌试管中，及时送检。2.3 粪便 : 取有粘液、脓血部分的粪便置玻璃大便专用管中，如为稀水便，可直接收集于玻璃管中，及时送检。2.4 眼、耳、鼻、喉拭子: 将棉拭子沾取少许无菌生理盐水（如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上挤去多余的水份） ，然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌试管内, 及时送检。2.5 脓液 : 用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌试管中，及时送检。2.6 血液 :2.6.1 凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用

18、抗菌素前采血，如已使用抗菌素，应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。当然在病人发热或寒颤时采集也可。2.6.2 成人每次采血 510ml,小儿采血23ml;2.6.3 严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀，2.6.4 从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。2.7穿刺液 : 胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液:严格无菌抽取后，注入含肝素抗凝的无菌试管中，轻轻颠倒试管10 余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的，或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。2.8 胆汁：由专科医生以无菌方法取引流液10m

19、l注入无菌试管。2.9 脑脊液：以无菌方法取脑脊液3-5ml,置无菌试管内，常温保存送检，如只 做培养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。2.10 生殖器官标本: 阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无 菌试管内送检。如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。 2.11 烧伤标本: 以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌试管中 . 2.12 支原体 (解脲、人型)培养 +药敏的标本采集2.12.1. 支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。 2.12.2 男性 : 用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内

20、2.5-3cm。3. 临床标本的保存细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。细菌室室内质控失控处理程序一、 BacT/Alert 120 血培养仪室内质控处理程序1( 当 BacT/Alert 120 血培养仪质控失败时，2( 仪器会提示你对该瓶孔进行定标， 3( 通常定标4( 都能通过，5( 只要定标6( 过了， 7( 仪器就能正常工作。8( 如仪器定标9( 不 10( 能通过，11( 就要请厂家工程师对仪器进行检测，12( 并对仪器的有关参数进行调整，13( 直到仪器合格后才能进行日常工作并填写失控报告Vitek-32 细菌鉴定及药敏分析仪室内质控处理程序14( 每批新购买的试剂

21、必须进行室内质控，15( 当质控结果不16( 能符合要求时， 17( 应通知组长协助处理，18( 进行失控原因分析。19( 失控原因分析与处理2.1 失控的原因分析2.1.1 自身原因2.1.1.1 质控菌株、卡片、无菌盐水等出现质量问题。2.1.1.2 质控菌株不符合所检测卡片的要求。2.1.1.3 上卡操作中出现问题，如菌液浓度不准等2.1.1.4 仪器工作是否正常。2.1.1.5 室温是否符合分析要求。2.2 失控的处理2.2.1 操作不规范时应严格按作业指导书重新检测一次。仍失控进行下一步。2.2.2 检查质控菌株及卡片是否在有效期内，质量如何, 无菌盐水是否被污染以及标准菌株是否符合

22、卡片的要求等。在保证质控菌株、卡片、无菌盐水等符合要求的情况下仍失控则进行下一步。2.2.3 做可能影响检测的仪器相应部分保养，仍失控进行下一步。2.2.4 请仪器工程师分析。写失控报告。直到质控在控后重新检测。标本拒收标准1. 支原体培养、鉴定、计数、药敏操作: 若送检标本不是运送培养基送检则为不合格标本。2. 找抗酸杆菌: 穿刺液标本如发现严重凝固则拒收。3. 脑脊液培养: 如标本为非无菌管采集则拒收。4. 中段尿培养: 如标本为非无菌管采集则拒收。5. 下呼吸道标本培养：挑取痰标本直接涂片镜检，WBC,10/LP上皮细胞，25/LP不适合做细菌培养。6. 脓液及创伤分泌物培养: 如标本为

23、非无菌管采集则拒收。7. 穿刺液培养: 如标本为非无菌管采集则拒收。8. 生殖道分泌物培养: 如为淋球菌培养没有直接接种到淋球菌培养基上则拒收。 9. 各类培养标本原则上都要求无菌采集并及时送检、及时接种、及时培养，不能保存。除非特殊情况可置于冰箱保存，对分离怕冷的细菌时，应注意标本的保暖。温度失控处理措施1. 每天上班记录培养箱、冰箱的温度于温度记录本上，如发现普通培养箱的温度超过 37?（不包括 37?）或低于34?（不包括34?）; 真菌培养箱温度超过31?（不包括31?） 或低于25?（不包括25?）; 冷藏冰箱的温度超过8?（不包括 8?）或低于2?（不包括 2?）; 冷冻冰箱的温度

24、超过-10?（ 不包括 -10?） 或低于 -30?（ 不包括 -30?） ，应立即追溯其失控的时间和原因。1.1 如失控的原因可以马上纠正（ 如冰箱断电、冰箱门未关好、温控调节器未正确控制、冰箱严重结霜、温度计损坏等） ，则由本室人员马上纠正并填写失控报告。 1.2 如冰箱、培养箱本身出现机械故障，本室人员应马上通知维修部或维修商，同时根据排除故障时间的长短是否会对其中的物品质量造成影响而采取相应的措施 （ 如把里面的物品转移到能满足需要条件的环境中） ，并填写失控报告单。2. 培养箱中的培养物应全部拿到工作台，检查培养物的生长情况。2.1 . 如果培养基的菌落生长良好，则按常规程序进行检验

25、。2.2 （ 如果培养基的菌落生长受抑制，则取标本重新接种，如标本确实无法再次接种，则应与临床医生联系、解释并请医生重新采集标本送检。2.3 （ 如有细菌生长，则应补做药敏试验，并填写迟发报告单记录表，并写明原因。3. 故障处理过程中应及时贴上红色标识，并在温度记录本上用红笔记录失控的温度度数，故障处理后应利用培养箱、冰箱的温度调节器，把温度调回到规定范围的中值，并把专业人员的检查的结果记录在仪器档案袋中。另外还需填写内部质量控制失控报告单，当温度再次是失控时，再次记录温度的读数，并且上报负责人。超净工作台1. 目的 规范净化工作台操作与维护工作，确保仪器正常运作。2. 适用范围: 本实验方法

26、适用于微生物检验中净化工作台操作与维护管理。3.检验人员职责: 负责此仪器操作和维护管理4. 操作及维护规程4.1 操作规程4.1.1 使用工作台时，应提前50分钟开机，同时开启紫外杀菌灯，处理操作区内表面积累的微生物，30 分钟后关闭杀菌灯（ 此时日光灯即开启） ，启动风机。4.1.2 对新安装的或长期未使用的工作台，使用前必需对工作台和周围环镜先用超静真空吸尘器或用不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。4.1.3 操作区内不允许存放不必要的物品，保持工作区的洁净气流流型不受干扰。 4.1.4 操作区内尽量避免作用明显扰乱气流流型的动作。4.1.5 操作区

27、的使用温度不可以超过60?。4.2 维护规程及维护方法4.2.1 根据环境的洁净程度，可定期（一般 2,3 个月 ）将粗滤布 （涤纶无纺布）拆下清洗或给予更换。4.2.2 定期 （一般为一周）对环境周围进行灭菌工作，同时经常用纱布沾酒精或丙酮等有机溶剂将紫外线杀菌灯表面擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌效果。4.2.3当加大风机电压已不能使风速达到0.32m/s 时必须更换高效空气过滤器。4.2.4更换过滤器时，可打开顶盖，更换时应注意过滤器上的箭头标志，箭头指向即为层流气流向。4.2.5 更换高效过滤器后，应用Y09-4 型尘埃粒子计数器四周边框密封是否良好，调节风机电压，使操作区平均风速

28、保持在0.32-0.48m/s 范围内，再用Y09-4型尘埃粒子计数器检查洁净度。标本的接种和移种法接种标本是细菌实验室的一项基本操作技能，目的是使细菌能得到充分的生长和能分离出单个菌落获得纯培养而供分析鉴定之用，所以作此项技术的操作应按以: 1. 左手的操作要点: 左手负责持平板、试管、烧瓶等物品，操作中，左手应尽量减少摆动，否则，不利于保持物品的无菌状态。1.1 左手持物品时，最好固定在一个空间方位上，以避免因移动使空气中的细菌进入器皿，造成随机性污染。1.2 所持的器皿其开口尽量避免向上，持平皿时，可以让平板的表面与地面尽量垂直，试管与器皿烧瓶也可倾斜。当从标本器皿或平板上挑取接种物或菌

29、落后应立即塞上试管塞或扣上平皿，随即接种标本。2. 右手的操作要点: 握有接种工具的右手，将接种环或针沿伸到标本之前应作好接种环或针，镊子等工具的火焰消毒工作，待冷却后才沿伸到标本容器中挑取接种物，在挑取标本后，其接种工具应尽量避免接触试管壁及试管口等。随后将接种物在培养基上分离划线。3. 移种或接种的基本步骤:2.1 右手持接种工具，在火焰上烧灼3次灭菌。2.2 左手持起标本容器或原代培养物的平皿或试管等。2.3 用接种工具挑取适量标本或细菌，挑取标本时，应注意选择真实反映感染情况的部分，如粪便挑取粘液脓血部分。纯化细菌应从原代培养物上挑取单个菌落。从液体培养基中取菌，只需将接种环在培养液中

30、蘸取一环即可。2.4 接种时可根据要求采用不同的接种方法。2.5 接种后，应在火焰上反复烧灼接种工具并作一定的编号记录，所用工具应放回原处。常用分离培养基2.6 用分离培养基种类：血平板、巧克力平板、麦康凯平板、 SS平板、克氏双 糖铁(KIA)、M-H培养基、4 号培养基、念珠菌药敏 养基、 念珠菌药敏平板。 2. 平板培养基均由郑州博赛、杭州天和药业公司生产。3. 生产批号:4. 用途 :4.1 血平板适用各类细菌生长，为一般细菌标本接种常用培养基。4.2 巧克力平板适用于某些血平板生长不良或需嗜血因子细菌的培养。4.3 麦康凯平板作初步是否发酵乳糖鉴定之用，主要用于粪便标本分离培养及作非

31、发酵菌生长试验用。4.4 SS 平板主要用于粪便标本分离培养及非发酵菌生长试验之用。4.5 克氏双糖铁(KIA) 主要用于观察细菌是否发酵葡萄糖、乳糖产气产酸，是否产生H2s及观察动力。4.6 M-H 培养基主要用于药敏试验。4.7 营养琼脂平板用于菌种保存、纯分离及作空气培养。4.8 沙保氏培养基用于真菌培养。5( 质控 : 每次用标准菌株进行生长试验和抑菌试验质控。质控合格后，方可使用，并认真做好记录。6( 注意事项:6.1 对每批培养基必须检查: 平皿的裂纹、充碟不均、培养基裂纹、溶血(血平板 ) 、冷冻、过多的气泡或斑点、污染等。6.2 缺陷性报告: 如果发现培养基有缺陷，实验室应做好

32、记录并通知制造商，制造商应有适当的改进措施，并记录在案。细菌室标本操作流程1. 标本的接受1.1 标本接受的时间: 原则上全天任何时间均可。1.2 标本的接受: 接受标本者要认真核对标本的数量、标本与检验单要求是否相符以及标本的质量等。1.3 把接受的标本编号。2. 临床标本的接种2.1 检验目的为细菌培养+药敏试验的各临床标本的培养基选择2.1.1 标本类型培养基血 血培养瓶中段尿血平板、麦康凯平板、L菌平板脑脊液血培养瓶、血平板、巧克力平板穿刺液血培养瓶、血平板、麦康凯平板、巧克力平板胆汁 肉汤、血平板、巧克力平板、麦康凯平板呼吸道标本血平板、麦康凯平板、巧克力平板粪便标本SS平板、MAC

33、f板和血平板病灶分泌物血平板、巧克力平板、麦康凯平板2.1.2 生殖器标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作: 淋球菌培养接种淋球菌平板; 念珠菌培养接种沙保罗培养基; 支原体培养则按支原体培养的操作规程操作; 作普通细菌培养, 则接种血平板和巧克力平板; 衣原体抗原检测的按衣原体抗原检测的操作规程进行检验2.2 接种的方法: 中段尿标本无菌取10ul ，在血平板的中间做垂直划线，然后分离划线。其他标本做分区划线。2.3 检验目的为找抗酸杆菌的按找抗酸杆菌的操作规程进行检验。3. 所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期，然后根据要求进行培养。4. 标本的培养条件、温度、时间平板

34、 培养条件、温度、CO寐度、时间血平板CO2孵箱、35-37?、18-24小时巧克力平板CO2孵箱、35-37?、18-24小时淋球菌平板CO2孵箱、35-37?、18-24小时沙保罗平板CO2孵箱、28-31?、24-36小时其他的平板CO2孵箱、35-37?、18-24小时5. 根据生长在平板上的细菌菌落形态、菌落涂片、染色、镜检等来综合判断细菌形态和染色性质，按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药敏试验。6. 结果的报告确认细菌鉴定及药敏试验结果后，进行检验验单结果报告的存盘、打印。7.对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室细菌标本在接种后每天按要求进行无害化处理。二氧化碳培养法目

35、的是用于分离和培养需CO2H体生长的细菌或只有在CO2W境中细菌生长形态典型的细菌。一般临床细菌实验室须配备一个 CO邪养装置，其一为专用的CO2培养箱，其二为烛缸CO2环境。一般实验室两者必须具备其一。我室采用 CO2ff箱。做法如下：调节CO2孵箱正面的温度调节钮，使其温度在 35+1现围。调节CO2孵箱正面的CO2a度调节钮，使其CO2»度在5-10%范围。将种有标本的平板放入CO2W箱培养。关好孵箱门，避免由于门未关好造成的温度、CO寐度低于允许范围。分离及纯化法1. 分离是指从原材料或多种细菌的混合培养物中将各种细菌彼此独立地分离开，以得到纯的单一菌株，技术步骤如下:作纯培

36、养分离时，一般只用一只完整的琼脂平板。涂划多采用分区划线法，在一只平板中可划3,5 个区。划法有两种: -1.1 从临床标本分离细菌所含菌数相对较少时，可用接种环取标本涂布在平板一角边缘，然后从此区开始划线至1/3平板，为第一区，再在2、3区依次划线每划完一个区域均将接种环灭菌一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线均接触上一区域的接种线12次，使菌量逐渐减少以获得单个菌落。1.2 快速划线分离法: 采用快速划线使一接种环标本能分离出单个菌落，这与标本的菌量及操作者的技能有很大关系。2. 纯化是指欲获得大量纯培养物的方法，所用平板大小可根据需要的菌量而定。方法是将一单个菌落或将相同的菌落作大量

37、密集涂划于平板上而获得大量纯的培养物。显微镜检查法显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。1. 不染色标本的检查: 不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。1.1 压滴法 : 用接种环取细菌悬液2环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。1.2 悬滴法 : 取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1 块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中

38、央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。2. 染色标本检查法: 通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。2.1 快速革兰染色法2.1.1 操作见试剂说明书2.1.2 结果 : 革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。2.1.3 注意事项: 染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定

39、不宜过热，脱色不宜过度，菌龄为 18,24 小时为佳。2.2 抗酸染色法2.2.1 操作见试剂说明书2.2.2 结果 : 抗酸杆菌呈红色。2.2.3 注意事项 : 每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，脱色时间宁长勿短，至无红色液体流下为止。2.3 阿尔培异染颗粒染色法:2.3 .1 初染 : 涂片上滴加第一液染剂（甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液），染 3-5 分钟，水洗。2.3.2 复染 : 第二液染剂（碘化钾溶液）染 1 分钟，水洗。自然干燥后镜检。 2.3.3 结果 : 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。2.4 .4 注意事项 : 玻片

40、要清洁，染料需新鲜配制，无沉淀物。注意与标本中的其他杂质相区别。3. 压片镜检，主要观察细菌在组织中的分布。4. 墨汁负染镜检: 背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等。5. 鞭毛染色镜检，观察细菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的数量，在非发酵菌的鉴定中是一项重要的指标。6. 暗视野镜检: 观察一些较微小且有一定结构的微生物，如钩端螺旋体的钩状及螺旋的形态等。7. 制动试验的直接镜检，在标本加入抗血清，观察动力是否被抑制，如霍乱弧 菌的制动试验等。8. 荧光镜检，用标有荧光素的物质与检材中的微生物特异结合产生荧光的特点而对微生物作出鉴定。穿刺液标本的细菌学检验1. 标本采集1

41、.1 穿刺液包括胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等。1.2 一般由临床医师以无菌操作穿刺术抽取。胸腹水抽取5,10 毫升，心包液、关节液等可抽取2,5m1,将所取得之样本注入含有抗凝剂的无菌管内充分混匀后送检。1.3 标本采集最好能在停药2 天后进行，如不能停药，则应在下次用药前采集，如疑为淋病性关节炎患者，其标本应在采集后立即送检或床边直接接种，切不可放冰箱保存。2. 检验步骤2.1 涂片检查标本 3000r/min 离心 l5 分钟后，取沉淀物制片。2.2 涂片镜检的细菌常为一般致病菌、革兰氏阴性双球菌和抗酸杆菌等，涂片检查应根据项目要求进行相应的染色镜检。2.3 培养 : 作一般细菌培

42、养可把采集的标本接种于血平板、麦康凯、巧克力平板，同时也可将标本注入血培养瓶放入血培养仪培养。2.4 作厌氧培养可采用直接床边接种标本或采集样本后，将培养物直接注入厌氧增菌培养基。3. 操作流程穿刺液厌氧涂片革兰氏染色需氧注入血培养瓶厌氧平板血平板放入血培养仪厌氧肉汤初步报告麦康凯阳性报警巧克力 分离培养涂片染色Vitek-32 鉴定、药敏/BD 凤凰鉴定、药敏确定报告4. 报告结果4.1 涂片报告发现形似某某细菌，淋球菌应报是否在细胞内外发现革兰氏阴性双球菌 ; 抗酸染色应报是否发现抗酸杆菌。4.2 用于培养的穿刺液正常情况下应无菌，如培养出细菌应报细菌种名及药敏试验结果，血培养仪培养6 天

43、仍未发现细菌则报无菌生长。胆汁标本的细菌学检验胆汁培养常见病原菌革兰阳性菌革兰阴性菌肠球菌 大肠埃希菌消化链球菌肺炎克雷伯氏菌葡萄球菌变形杆菌产气肠杆菌铜绿假单胞菌伤寒及其它沙门菌拟杆菌粪产硷杆菌2. 标本收集胆汁标本的采集方法有三种，即十二指肠引流法，胆囊穿刺法及手术直接采取法。 2.1 十二指肠引流法: 在无菌操作下用导管作十二指肠引流胆汁，分为A、 B、C三部分。A液来自胆管，为橙黄或金黄；B液来自胆囊，为棕黄绿色；C液来自肝胆道，为柠檬色。一般认为B 液做细菌培养意义较大。2.2 胆囊穿刺法: 进行胆囊造影时同时采取胆汁。本法所采取的胆汁不易被污染，适宜做细菌培养。2.3 手术采取法:

44、 在进行胆部外科手术时直接采取胆汁送检。3. 检验步骤3.2 将送检标本3000r/min 离心 30 分钟，倾去上清液取沉淀物涂片及培养。3.3 胆汁一般不作涂片检验，如需要应用相应的染色方法检查并仔细观察，因为胆汁沉淀后有较多的内容物复盖而不利于观察细菌。3.4 培养提倡直接将胆汁注入血培养瓶进行增菌培养。培养标本也可直接种血平板、麦康凯平板和巧克力平板。4. 操作流程胆汁需氧 血培养瓶增菌涂片染色血平板、巧克力平板血平板、巧克力平板初步报告麦康凯菌落观察涂片染色Vitek-32 鉴定、药敏/BD 凤凰鉴定、药敏确定报告5. 报告结果5.2 沙门氏菌感染在胆汁中检出率较高，但必须以血清凝集

45、试验为依据报告血清型。 5.2 胆汁应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌应报细菌的种属及药敏试验结果。粪便标本的细菌学检验1. 粪便标本中常见病原菌革兰阳性菌革兰阴性菌金黄色葡萄球菌伤寒及其它沙门菌结核分支杆菌志贺菌属难辨梭菌致病大肠埃希菌白色念珠菌（ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC）弧菌属菌种气单胞、邻单胞菌种小肠结肠炎耶尔森菌弯曲菌2. 标本采集2.1 自然排便采集法 自然排便后，挑取脓血、粘膜部分的粪便2,3g,液体粪便取絮状物置于大便培养管或增菌液中送检。2.2 直肠肛管法 用大使培养用的肛管直接插入肛门成人4,5cm,幼儿2,3cm,轻轻在直肠内旋转数次，目的是使直肠表面粘

46、液能通过肛管孔进入肛管内。然后拔出放入大便培养管中送检。3. 检验步骤3.1 涂片检查粪便标本因各种正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有怀疑霍乱弧菌及菌群失调所致腹泻时，才作直接涂片检查。3.2 各项的涂片检验均按染色方法进行，但大便检查霍乱弧菌有其处理程序:3.2.1 染色检查 : 将米泔样的标本涂2张片用乙醇固定后染色，目的观察弧菌有无呈鱼群状排列。3.2.2 悬滴检查取患者粪便制成悬滴涂片，霍乱弧菌和EI tor 弧菌均呈现极活泼的穿梭状运动。3.2.3 制动检验运动活泼的弧菌涂片加人霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。3.3 大便标本

47、的培养目的是培养致病菌或追踪病人有否菌群失调现象，无特殊要求作一般致病菌培养的标本接种麦康凯、SS平板各一个。3.4 菌群失调的细菌学检验：选用多种培养基包括SS麦康凯、血平板、高盐 甘露醇盐琼脂平板、Campy-BAto琼脂平板和沙氏琼脂等，目的是使更多的菌群得 到生长，以利于检查肠道的细菌情况。3.5 霍乱弧菌的培养，直接取患者米泊样粪便 0.5ml ,接种于碱性蛋白陈水增 菌液和4号平板，35?培养6,8h ,再转种一只4号平板。35?培养18,24h后形成较 大、菌落中间为灰黑色、有光泽、隆起、湿润的菌落，如泼水状。挑取可疑菌落5,10个与霍乱多价" O'诊断血清作玻

48、片凝集试验，如为阳性，则立即报告，并将可疑菌送成都市疾病控制中心确认。3.6 作结核菌培养应先处理（参照杂菌处理方法篇章介绍）后种入改良罗氏培养基中或 magot培养基。3.7 厌氧性难辨梭菌的培养参照厌氧培养。3.8 真菌培养: 真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后，常见的真菌腹泻多由白色假丝酵母菌引起。将标本接种于沙氏平板及血平板上，置 27?和35?培养18,24h,根 据形态染色、菌落特征或采用 VITEK-32 YBC或API Aux半自动条鉴定，并做 ATB Fungus药敏试验。4.操作流程粪便或肛拭子增菌培养分离培养涂片检查沙门氏菌、志贺氏菌35?18,24h霍乱弧菌SS麦康凯平板革

49、兰氏染色观察动力沙氏斜面、血平板等菌落观察涂片检查血清学鉴定Vitek-32 鉴定、药敏/BD 凤凰鉴定、药敏确定报告5. 报告结果: 查出肠道致病菌，报告其菌名和药敏结果。如为致病性大肠埃希菌必须以血清学诊断试验为鉴定依据，报告应包括ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC。6. 粪便中培养出霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌时应作为危急值报告，并填写几危急值报告单。血液及骨髓标本的细菌学检验血液及骨髓标本中常见病原菌革兰阳性菌革兰阴性菌肺炎链球菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌伤寒及其它沙门菌表皮葡萄球菌变形杆菌溶血性链球菌产气肠杆菌粪肠球菌肺炎克雷伯氏菌铜绿假单胞菌粪产硷杆菌沙雷氏

50、菌流感嗜血杆菌布鲁氏菌2. 标本采集2.1 采血时间 : 在病人发热初期1-2 天内或发热高峰时采集血液标本。采血时间原则上应选择在抗菌药物应用前, 对已用药而又不能中止用药的病人，应在下次用药前采集。2.2 标本采集方法及标本量成人每次采血10ml,婴幼儿每次采血1-5ml。严格无菌采集的血液标本应立即加入血培养瓶内，迅速轻摇，使之充分混合，以防血液凝固。对于疑为细菌性骨髓炎病人，应在严格消毒后抽取骨髓1ml 然后注入小儿瓶中进行增菌培养。3. 操作流程血液无菌注入血培养瓶2.3 天无菌生长增菌培养血平板 阳性报警巧克力平板无菌生长发阴性报告涂片染色血平板初步报告巧克力平板（5%CO条件）3

51、5-37?， 18-24 小时菌落观察、涂片染色及相关酶试验Vitek-32 鉴定、药敏/BD 凤凰鉴定、药敏确定报告检验科作业指导书血液及骨髓标本的细菌学检验文件编号:LAB,OP,XJ026 第 2页，共2页版本 :1生效日期:2005-11-014. 报告结果4.2 血4.1 在血液中检出沙门氏菌，必须以血清凝集试验为依据报告血清型。液正常情况下应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌，应报细菌的种属及药敏试验结果。4.3 血培养阳性均作为危急值报告，并填写危急值报告单。编写 : 审核 : 批准 :批准日期:2005 年 11 月 01 日脑脊液的细菌学检验脑脊液培养常见病原菌革兰阳性菌革兰阴

52、性菌金黄色葡萄球菌脑膜炎奈瑟菌A、B群链球菌卡他布兰汉菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌结核分支杆菌肠杆菌科菌种产单核李斯特菌脑膜败血性黄杆菌新型隐球菌假单胞菌白色念珠菌2. 标本收集:2.1 标本必须由临床医师以无菌操作收集脑脊液3,5ml ，盛于无菌管中送检。脑脊液中某些细菌（ 脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等） 易死亡，故收集标本后应立即送检。切不可低温（ 冰箱 ） 保存。3. 检验步骤:3.1 一般细菌涂片检查除结核性脑膜炎外，由其它细菌引起的化脓性脑膜炎，脑脊液明显混浊，可直接涂片，革兰染色镜检。无色透明的脑脊液，应离心后涂片、染色、镜检，根据染色及形态特征可初步提示细菌的种类。结核分

53、枝杆菌涂片检查 : 取脑脊液的离心沉淀物(3000r/min,30min) 作抗酸染色。新型隐球菌涂片检查取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色。3.2 分离培养用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血平板、巧克力平板，巧克力平板应置于CO冰境中35?培养18,24小时。脑脊液也可直接注入血培养瓶放入BacT/Alert 120 或 BACTEC 9050中进行监测。4. 检验流程:脑脊液3000r/min 10,15min 3000r/min 10,15min肉眼观察BacT/Alert 监测 培养检查涂片检查阳性报警血平板巧克力平板(5,10%CO2)5 天无菌生长报阴性观察菌落

54、墨汁染色革兰氏染色抗酸染色涂片检查血清学试验Vitek-32 鉴定、药敏/BD 凤凰鉴定、药敏确定报告5. 报告结果: 检出细菌，应报告菌名和药敏结果，血培养仪培养6 天仍无生长者则报告阴性。6( 阳性培养结果应作危急值报告，并填写危急值报告单。尿液的细菌学检验1. 尿液培养常见病原菌革兰阳性菌革兰阴性菌金黄色葡萄球菌淋病奈瑟菌肠球菌 大肠埃希菌A群链球菌变形杆菌腐生葡萄球菌肺炎克雷伯菌表皮葡萄球菌产气肠杆菌结核分支杆菌沙门菌种铜绿假单胞菌沙雷菌2. 标本收集:2.1 尿液标本的采集可采用多种方法: 有中段尿采集法、膀胱穿刺法、肾盂尿采集法，而常规是取中段尿作细菌培养。2.2 取中段尿作培养时先要进行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染标本。 2.3 如采用其他方法收集标本，必须由临床医生根据临床诊断需要而执行收集术，并在检验单上写明。3. 检验步骤:3.1 涂片检查3.1.1 一般细菌及淋病奈瑟菌涂片: 以无菌操作吸取尿液10ml， 3000r/