阿霉素合用化疗耐受逆转剂对肾癌细胞的体外逆转试验

1、    阿霉素合用化疗耐受逆转剂对肾癌 细胞的体外逆转试验        【摘要】目的探讨逆转肾癌细胞对化疗药物的耐受。方法采用四种不同类型的逆转剂：异博定、Buthionine sulfoximine (BSO)、三苯氧胺、环孢素A，以单药或多药组合的方式与阿霉素联合应用，与肾癌细胞共同培养。MTT染色法检测细胞生长抑制率。结果单药应用中以异博定的逆转效果最好，对肾癌细胞生长抑制率达34%(P0.05)，多药组合中以异博定+BSO+三苯氧胺更为有效，对肾癌细胞生长

2、抑制率达50.8%(P0.05)。结论多药组合逆转较单药应用更为有效。两种不同逆转机制的逆转剂联用，较两种同为P-170的逆转剂联用效果更好。【关键词】肾肿瘤癌药物耐受性 Combined use of doxorubicin and modulators to revert the multidrug resistance of renal cancer cell lineREN Laicheng,XUE Zhaoying,YU Lizhang.Department of Urology,the Second Affiliated Hospital,Shanxi Medical Univer

3、sity,Taiyuan 030001【Abstract】ObjectiveTo revert the multidrug resistance of renal cancer cell line (GRC-1).Mathods4 modulators (verapamil,tamoxifen,buthionine sulfoximine (BSO),cyclosporin A) have been used combinedly with doxorubicin in culturing with GRC-1.MTT staining assay was carried out to mea

4、sure the reversal of the drug resistance by the modulators.ResultsAmong the single modulator regimens,ve-rapamil revealed the strongest reversal effect on drug resistance,the human renal cancer cell line inhibition rate being 34% (P0.05).Among the multimodulator regimens,verapamil+tamoxifen and BSO

5、was the more effective,the inhibition rate being 50.8% (P0.05).ConclusionsMultimodulator regimen was more potent than the single modulator regimen.Using 2 modulators with different reverse mechanism would be more potent than using modulators of the same reverse mechanism.【Key word】Kidney neoplasmsCa

6、rcinomaDrug tolerance近10年来对肿瘤的耐药机制和各种逆转剂分别进行了大量的研究1，2。虽然在细胞株和动物模型上取得良好逆转效果，但在临床实验中都未获理想疗效。本实验用四种不同类型逆转剂，并采用不同组合方案，以探索一种理想的逆转方案。材料与方法一、材料肾癌细胞株GRC-1来自北京医科大学泌尿外科研究所，RPMI1640培养液为美国GIBCO产品，SLT spectra酶标仪、CO2培养箱、96孔培养板均为美国产品，观察用日本Olympus倒置显微镜。阿霉素(ADM，上海联谊制药厂)；3-4，5甲基-2-噻唑基-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)、异博定(VPM)、Buthi

7、onine sulfoximine(BSO)均为美国Sigma公司产品；环孢素A(CsA，瑞士Sandoz)；三苯氧胺(Tamoxifen,北京医科大学实验药厂)；二甲基亚砜(DMSO，北京化学试剂厂)。二、实验方法96孔培养板，每孔接种1×104细胞(0.1ml)，BSO实验组同时加入BSO。5% CO2，37培养14小时后单用组分别加入异博定(10mol/ml)、BSO(200mol/ml)、三苯氧胺(10mol/ml)、环孢素A(10mol/ml)。多药组合组分别加入异博定+BSO；异博定+BSO+三苯氧胺；异博定+环孢素A；环孢素A+BSO。各药浓度同单用组。对照组加入等体积

8、RPMI 1640。再培养10小时后，每孔加入10g/ml阿霉素0.1ml，对照组加入等体积RPMI 1640培养液。培养48小时后，吸出培养液，然后以MTT法检测细胞生存率3三、统计学分析检测结果做q检验。结果单用阿霉素细胞生长抑制率为(16.7±2.8)%，阿霉素、异博定联用为(34.0±2.6)%，阿霉素、BSO联用为(21.5±0.4)%，阿霉素、三苯氧胺联用为(25.6±3.5)%，阿霉素、环孢素A联用为(22.9±2.7)%。异博定的逆转效果明显强于其它三药(P0.05)，BSO、三苯氧胺、环孢素A三药的逆转效果差异无显著性(P0.

9、10)。四种逆转剂相互组合与阿霉素合用，单用阿霉素细胞生长抑制率为(16.7±2.8)%，阿霉素、异博定、BSO联用为(48.5±0.4)%，阿霉素、异博定、BSO、三苯氧胺联用为(50.8±1.9)%，阿霉素、异博定、环孢霉素A联用为(32.9±3.2)%，阿霉素、环孢霉素A、BSO联用为(24.9±3.3)%。以异博定、BSO、三苯氧胺联用的逆转效果优于其它方案(P0.05)。讨论多药耐药现象(MDR)主要由多药耐药基因(MDRI)编码、相对分子质量为170 000的穿膜糖蛋白(P-170 glycoprotein、P-170、P-gp)所

10、引起，P-170被认为是一耗能的“药物外排泵”，能迅速地将细胞内的药物排出，使化疗药物不能发挥其作用，从而导致MDR4。Tsuruo等2首先报道异博定可逆转MDR后，许多药物被相继报道具有逆转作用5，它们主要是钙通道阻滞剂(VPM等)、环孢素类、激素类(Tamoxifen等)以及其它药物。这些药物都是P-170的作用底物，竞争性地与P-170结合而抑制化疗药物与P-170的结合，抑制化疗药物的“外排”，从而增加细胞内药物的聚集，逆转MDR。文献报道上述几类逆转效果有所不同6-8。本实验结果表明上述几类逆转剂中以异博定逆转效果最好，其余三类逆转效果差异无显著性。MDR现象除由P-170引起外，谷

11、胱甘肽(GSH)和它的相关酶谷胱甘肽过氧化物酶(GP)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)也是原因之一4。GSH在细胞的防御、解毒、运转、代谢等方面具有重要作用9，GSH可单独或在GP、GST的催化下与一些自由基、烷化基、外源性生物活性物质等结合，起到解毒作用10。而一些化疗药的自由基、烷化基正是其细胞毒效应基团，被GSH结合后丧失抗癌作用而导致MDR。BSO抑制GSH生物合成的限速酶-谷胺酰半胱氨酸合成酶，从而抑制GSH生物合成，降低细胞内GSH含量11，逆转MDR。我们选用异博定、BSO这两种不同作用机制的药物联用逆转MDR，结果显示逆转效果优于两种同为P-170抑制剂的合用。目前对肿瘤多药耐药的

12、逆转研究，在动物模型、体外实验中取得了理想的效果，但在临床应用中效果甚微，主要原因有(1)逆转剂的毒副作用限制其大剂量应用，使血浆药物难以达到体外逆转所需浓度。(2)血浆蛋白的影响，与血浆蛋白亲和性低的逆转剂，很容易扩散到细胞发挥生物活性；相反，血浆蛋白亲和性高的逆转剂要在体内达到逆转浓度，所需剂量较大，毒副作用也大。(3)逆转剂与化疗药物相互作用，使药物代谢、清除发生改变，影响疗效。(4)有数种耐药机制参与MDR，而只对一种机制逆转很难发挥作用。以上几点在临床设计逆转方案时应予重视。本实验结果显示，阿霉素与逆转剂结合应用可逆转MDR，单种逆转剂中以异博定逆转效果最好，两种逆转剂联用以异博定+

13、BSO效果最佳，两种逆转剂联用效果比单剂逆转效果更好，两种不同逆转机制的逆转剂联用，较两种P-170的抑制剂联用效果更佳。作者单位：任来成（030001 太原，山西医科大学第二医院泌尿外科）薛兆英俞莉章（北京医科大学第一医院泌尿外科）参考文献1Pastan I,Gottesman MM.Multiple drug resistance in human cancer.N End J Med,1987,3161388-1397.2Tsuruo T,Iida H,Tsukagoshi S,et al.Increased accumulation of vincristine and adriamy

14、cin in drug resistant P388 tumor cell following incubation with calcium antagonists and calmodulin and calmodulin inhibitors.Cancer Res,1982,424730-4733.3Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and surviral:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immuno Me-thods,1983,655

15、5-63.4Mickisch GH,Roehrich K,Koessig J,et al.Mechanisms and modulation of multidrug resistance in primary human renal cell carcinoma.J Urol,1990,144755-759.5Lum BI,Fisher GA,Brophy NA,et al.Clinical trials of modulation of multidrug resistance.Cancer,1993,723502-3541.6Mickisch GH,Kossig J,Tostado RK

16、,et al.Circumvention of multidrug resistance mediated by P-170 glycoprotein using calcium antagonists in primary human renal cell carcinoma.Urol Int,1991,47118-125.7Warner E,Tobe SW,Andrulis IL,et al.Phase - study of vinblastine and oral cyclosporin A in metastatic renal cell carcinoma.Am J Clin Onc

17、ol,1995,18251-256.8Millward MJ,Lien EA,Robinson A,et al.High-dose (480mg/day) tamoxifen with etoposide:a study of a potential multidrug resistance modulator.Oncology,1994,5179-83.9Mizutani Y,Youshida O.Overcoming tumor necrosis factor- resistance of human renal and ovarian carcinoma cell by combination treatment with buthionine sultoximine and tumor necrosis factor-.Cancer,1994,73730-736.10Arrick BA,Nathan CF.Glutathione metabolism as a determinan