酶工程实验指导

1、.广东省高教厅重点实验室现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007 年 11 月.编者的话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室， 面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设 酶工程实验技术 课程。该课程以实验为主， 为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修 “酶工程与蛋白质工程 ”。本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分 ， 具体如下：内容实验序号实验项目名称I、酶源的获取1， 5

2、产淀粉酶菌株的快速筛选、木瓜蛋白酶制剂的制备2鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离II 、酶制剂的分3纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析离纯化及鉴定4纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析分析5木瓜蛋白酶制剂的制备III 、酶制剂的体6壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶外改造*实验 8中过氧化物酶在滤纸上固定化的部分亦属此部分内容。IV、酶制剂的应7酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备用8消毒液中过氧化氢浓度的酶试纸法测定V 酶基因的重组9邻苯二酚双加氧酶基因在大肠杆菌中的高效重组表达表达VI 实验总结及演实验总结等。示等为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参

3、加编写，在此一并表示感谢！本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。.编者2006 年 11 月实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为 RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。图1 产淀粉酶菌

4、落形成的透明圈三、材料、试剂和仪器1 、菌的来源取不同地点的表层土壤。2 、试剂：RBV-Starch （ Sigma ） , NaNO 3, K 2HPO4, MgSO 4 , KCl, 2 mol/L NaOH无菌水和琼脂粉等。3 、器皿250mL 三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200 L移液枪、200 L枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL 具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。4 、仪器设备高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。四、实验操作步骤.1 、器皿的消毒：培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121下灭菌

5、20 min ，取出备用。2 、培养基的配制与灭菌培 养基 的组 成为 ： RBV- 淀 粉（ 1.2%, w/v ） ，NaNO 3(0.2%,w/v),K2HPO4 (0.2%, w/v),MgSO4 ·7H2 O （ 0.1%, w/v） , KCl(0.1%, w/v),琼脂（ 2% , w/v） , 调 PH 至 6.0 左右。在三角瓶中，121 灭菌20 min ，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL ，静置凝固备用。（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀，影响菌落的观察。）3 、土样的采集及稀释于校园等不同地点采集土壤样品

6、；取样时，用取样器向下打取1cm 左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。4 、富集称取 5.0 g 混合土样和 0.5 g 的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养 24h 。5 、菌种的初筛称取 1.0g 步骤 4 所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌水至5mL ，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL 转移至另一刻度试管中， 加入 9mL 无菌水， 摇匀； 从第二支试管中取出1mL 转移至第三支刻度试管，加入 9mL 无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL 转移至第四

7、支刻度试管，加入9mL 无菌水，摇匀。如此重复即得到稀释倍数分别10、 100 、 1000 倍的土壤稀释液。用移液枪分别吸取稀释100 和 1000 倍的样品液50 L，加入至已凝固的培养基表面，用涂抹棒涂布均匀。将涂过样的培养皿倒置放置，于30培养箱里培养，观察菌落透明圈的出现情况。（一般 30h后即可出现一些透明圈）。6、菌株的纯化于超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成）用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分离能形成透明圈的单菌落。并在斜面培养基中保存。.图2 平板划线分离法示意图五、结果处理与分析1 、菌落产生透明

8、水解圈的观察用直尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的直径大小，求平均值，并计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。表1 不同菌落产淀粉酶能力的比较菌落编号菌落直径（mm ）透明圈直径(mm)透明圈直径/ 菌落直径菌落形态特征2 、侯选菌落的形态观察：观察并描述分离所得菌株的菌落形态，以大致了解产酶菌株属于那一类菌。3 、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是请分析原因。六、注意事项1、 进行无菌操作前，将接种所需用具放于台面铁架上，对超净工作台即周围环境进行75酒精喷雾，使灰尘沉降，打开紫外灯照射灭菌30min ，操作前，用75酒精喷手杀菌。（在本实验中省去此步）。2 、操作应尽

9、量靠里，在酒精灯的火焰旁工作。3 、实验过程中避免说话、走动。4 、每次涂板后涂布棒皆要用火焰灼烧灭菌，冷却后再涂下一块板。.实验二、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离一、目的学习和掌握亲和层析法分离纯化酶的基本原理和方法。二、原理许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合，特异性的抗体一抗原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互补DNA、 mRNA 及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均

10、属于专一性而可逆的结合，这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为 “生物专一吸附技术 ”或 “功能层析技术 ”。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。磁性亲和分离技术是将亲和

11、吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。溶菌酶（）广泛地存在于动物、植物和微生物中，其中鸡蛋清中的含量较为丰富。鸡蛋清溶菌酶的相对分子质量为14.6KD，由 129 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白，含有4 个S-S 键，在中性及偏酸性条件下结构较为稳定。溶菌酶能催化水解细菌细胞壁多糖的N- 乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的 -1 ，4 糖苷键，几丁质（又称甲壳素）则是这类细胞壁多糖的类似物，因此可利用溶菌酶与甲壳素间的特异结合来分离纯化溶菌酶。三、材料、试剂及仪器1、材料 新鲜鸡蛋清：取自市售的鸡蛋。 亲和层析介质：几丁质磁性凝胶介质（自制）。 溶壁微球菌 （Mic

12、rococcus Lysodeikticus）（ Sigma 公司）2、试剂 0.15N HAc ：吸取 18mL 冰乙酸，定容至1000 mL 。 10%的 HAc ：吸取 100mL 冰乙酸，用蒸馏水定容至1000 mL 。 0.2mol/L NaHCO 3 溶液：称取 16.8g NaHCO 3，溶解，定容到 1000mL 。 5mmol/L NaHCO 3 溶液（含 0.2 mol/L NaCl）：先将 0.2mol/L NaHCO3 稀释 40 倍，再于每升溶液中加入 NaCl 11.688g 。 5mmol/L NaHCO 3 溶液（不含 NaCl ）：将 0.2mol/L NaH

13、CO 3 稀释 40 倍。 10mmol/L NaHCO 3 溶液：将 0.2mol/L NaHCO 3 稀释 20 倍。 1/15 mol/L磷酸缓冲液 （ pH6.2 ）：Na2 HPO3·12H2 O4.7752g ，KH2PO4 7.2576g ，溶解，定容至 1000mL 。. 考马斯亮蓝G-250 ：称取 100mg 考马斯亮蓝溶于50mL 90%乙醇，加入85%磷酸 100mL ，用蒸馏水定容至 1000mL ，过滤。 2 mol/L NaOH：称取 80g 的 NaOH 定容至 1000 mL 。0.1mol/LpH 7.8磷酸缓冲液 (内含 0.5mol/LNH A

14、c)：称取 32.78g 的 Na HPO ·12H2O， 1.33g 的423NaHPO ·2H O, 38.54 g 的 NH Ac 溶解后，定容至 1000mL.24243、 仪器分部收集器、分光光度计、恒温水浴器、恒流泵、电子天平、强力电动搅拌器、抽滤装置。四、操作步骤（一）、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离1.亲和层析介质的再生和平衡：用3-4 个床体积的5mmol/L NaHCO3（含NaCl ）溶液淋洗亲和层析介质即可。（若发现介质上有太多杂蛋白和一些微生物污染，可用 0.5mlo/L的 NaOH 淋洗亲和层析进行在位清洗 ）2. 蛋清提取液的制备：取一个新鲜鸡蛋的

15、蛋清，用5mmol/LNaHCO 3 （不含 NaCl ）液搅匀并稀释至400mL ，双层尼龙布过滤，取滤液。（测定酶液总体积，并留1.0 mL 样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。3.酸和热变性：用10%的 HAc 将稀释后蛋清的pH 值调至4.5 ， 60水浴15 分钟，双层尼龙布过滤，取滤液，用2 mol/L的 NaOH 将上清的pH 值调回至7.0 （边缓慢加入NaOH 边搅拌，以免局部溶液pH 值过高和将pH 值调过头 ），（测定酶液总体积，并留1.0mL 样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。4.开放吸附：向步骤3 的上清液中加入上述平衡好的磁性凝胶介质，于烧

16、杯中用玻棒缓慢搅拌30 min（见图1-1 ）。（尽量缓慢地搅拌，以免破碎凝胶颗粒）。在此步骤中溶菌酶被亲和吸附到凝胶介质上。5. 介质的磁性回收及洗涤：用带环型条纹塑料外套的圆形铁氧体磁铁作为外磁场收集亲和介质，此时介质被吸附于塑料外套的表面，取出塑料外套中的磁铁将吸附于塑料外套的表面的介质悬浮于10mmol/L NaHCO3 溶液中，缓慢搅拌洗涤介质，磁性回收，如此洗涤介质2 次（见图 1 2,3 ）。将洗涤后的介质装柱（测柱径及层析床的高度）， 再用 pH 7.8 含 0.5mol/L NH4Ac 的 0.1mol/L磷酸钠盐缓冲液 (以下称溶液B)洗涤至流出液的A280 < 0.

17、05 时，再用 10mmol/LNaHCO3 溶液 20mL 洗涤以替换柱子中的溶液B，以便下一步的洗脱操作。.123图 1 鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和吸附分离1 溶菌酶的开放吸附；2 亲和介质的磁性收集；3 介质的洗涤6.洗脱： 用 0.15N HAc溶液进行洗脱，流速控制在30ml/h左右，分部收集 (4mL/ 管 ) ，分别测定A280nm（其可快速地监控蛋白的洗脱情况）和酶活性，收集活性部分即为纯化酶，4下保存备用。 （测定酶液总体积）。因本步骤所得酶液的活性很高，故应取部分酶液（如0.2mL ）稀释10 倍后再用于酶活性测定，而用于蛋白含量测定时则不必稀释）。7.用离心管保留粗提液及酸热

18、变性后的酶液，用刻度试管保留亲和层析后的酶液，放置在4 ，以备实验三和四使用。（二）、测定方法1.溶菌酶活性的测定原理：由于溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm 波长下吸光度下降的速度来表示酶活性。具体方法为： 将溶壁微球菌研磨并溶于0.1mol/L磷酸缓冲液 （ pH6.2 ）中，使其 A450nm 在 0.6-0.9间。吸取上述底物悬浮液2.0mL 于玻璃比色杯，然后加入0.05mL 酶液，用移液枪搅动迅速混匀，启动反应，测定1min 内 A450nm 的变化（ 用 0.1mol/L磷酸缓冲液调零，当盖上分光光度计

19、2-3 秒钟后开始用秒表计时并读数），每 15s 记录一次读数。酶活力的计算：首先要自定义酶活性单位 （ U）。定义在当前测定条件下， 使测定体系在 450 nm 波长下吸光度每分钟下降 0.01 所需的酶量为 1 个酶活力单位（ U）。酶液活力（ U/mL ） =A450/ min100 稀释倍数0.052. 蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250 法分析溶液中可溶性蛋白的含量。取50uL 的样品液加入.2.5mL的考马斯亮蓝G-250 溶液，摇匀，放置5 min 后，在 595nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算出蛋白含量。（由标准曲线求得的回归方程为：酶样蛋白含量：b (mg/mL)

20、= 1.674 ×A595nm- 0.0354 ）五、结果处理与分析1 、 绘制亲和层析洗脱曲线。（参考下图格式绘制）1.27000160000.15mol/l HAc50000.8mn08A400020.630000.420000.2100000051015202530管号（支）A280nmLysozyme activity)Lm/U(性活酶菌溶图 2鸡蛋清溶菌酶的亲和层析( 2.0× 15 cm )流速： 60 mL/h ； 4.0 mL/管2 、 制作纯化表。对每个纯化步骤中的酶样测定以下3 个指标：单位体积酶样的活性: a （ U/mL ） = A450 /（ 1.

21、0 min× 0.01× 0.05），mL即酶液活力。酶样的蛋白含量: b （ mg/mL ）、酶样总体积：c（ mL ）。由此即可制作如下纯化表：表 1 鸡蛋清溶菌酶纯化表纯化步骤总体积总蛋白总 活 性比活性回收率纯化倍数浓缩倍数（ mL ）（ mg)（ U）( U/mg 蛋白）（ %）（ ×）（ ×）粗提液C1b1×C1a1×C1a1 / b110011酸、热变性C2b2×C2a2×C2a2/ b2a2×C2a2/ b2a2/ a1a1×C1a1 /b1亲和层析C3b3×C3a3&

22、#215;C3a3 / b3a3×C3a3 /b3a3/ a1a1×C1a1 /b13、 常见的酶活性表示方法有那些（如：U/mL 酶液； U / mg protein; U/g干重或鲜重；U / g酶.粉等）？它们各有什么含义，适用哪些场合？4、 与一般介质相比磁性亲和介质有何优缺点？5、 层析操作中如何更换缓冲液？6、 如何保存介质？六、注意事项1、 搅拌开放吸附时，搅拌的速度不要太快，以免破坏介质，搅拌速度以能使介质悬浮即可。2、 装好层析柱后，应在介质的面上铺一张圆形的小滤纸片，以免在柱层析过程中介质被液滴冲起。.实验三、纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析一、目的了解酶（蛋

23、白质）纯度鉴定的常用手段。掌握用SDS-PAGE法进行蛋白纯度鉴定。二、原理蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学方法，如：电泳、HPLC 等。其中常用的电泳分析方法有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时，都将以单一的速度泳动，它的非变性电泳图谱应只呈现一条染色带。HPLC 常用于多肽、蛋白质纯度鉴定，纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。三、材料、试剂1. 材 料： 实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。2. 试剂： 溶壁微球菌 （ Micrococcus Lysodeikticus）（ Sigma 公司

24、）、丙烯酰胺（ Acr ）、甲叉双丙烯酰胺（ Bis）、甘氨酸、琼脂、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（ SDS）、巯基乙醇、溴酚兰、甘油、考马斯亮蓝R-250、甲醇、冰乙酸等。低分子量标准蛋白（上海生化研究所），（已处理好不必再加样品裂解液进行处理！）电泳试剂配制：（ 1）30%凝胶贮液： 取 30g 丙烯酰胺（ Acr ）， 0.8 g 甲叉双丙烯酰胺（ Bis）加水定容至 100mL ，过滤后置棕色瓶中，于 4保存备用。(2 ）电极缓冲液：Tris 3.03 g ，甘氨酸14.4 g ， SDS 1.0 g，溶解并定容至1000mL （ pH 值约 8.3 ） 。（ 3） 1

25、%琼脂糖溶液：1g 琼脂 +100mL 电极缓冲液加热溶解。（ 4）样品裂解液 （2× SDS加样缓冲液）：10 %SDS ：1.00 mL巯基乙醇：0.1mL浓缩胶 buffer ： 0.5 mL水：0.15mL共： 2.5mL甘油：0.5 mL2 % 溴酚兰：0.25mL（ 5）染色液：称考马斯亮蓝R-2500.5g，甲醇225 mL ，冰乙酸50mL，定容至 500 mL 。（ 6）脱色液： 取冰乙酸75 mL ，甲醇50 mL，定容至1000mL 。（ 7）分离胶缓冲液： 取 18.15 gTris 溶解后， 加 6mol/L HCl溶液 4mL ，调 pH 值至 8.8 ，

26、定容至 100 mL 。（ 8）浓缩胶缓冲液：取 6.0 gTris 溶解后，加6 mol/L HCl溶液 8mL ，调 pH 值至 6.8 ，定容至 100 mL 。（ 9） 10 SDS：取 10g 溶解后，定容到 100mL 。（ 10） 1过硫酸铵 ：取 0.1g 溶解后，定容到 10mL 。（ 11） TEMED：分装。其它试剂： 1mol/L NaOH ：称取 20g 的 NaOH 定容至 500 mL 。四、操作步骤1.封琼脂糖： 取加热溶解的1% 琼脂糖溶液，用滴管加入两玻璃板底部的凹槽中，冷却凝固以封住两玻板.间底部的缝隙。2. 分离胶制备： 加分离胶至玻板顶部 3cm 处，

27、立即覆盖水层，静置至胶与水层形成清晰的界面。3. 浓缩胶的制备： 倒去水层，用滤纸吸干，加浓缩胶，插入梳子，静置聚合。注意：每一次吸胶后，立即用蒸馏水洗净滴管及微量进样器，以免堵塞！附：胶溶液配方：分离胶12.5%15%30%凝胶贮液3.15 mL3.75 mL水2.1 mL1.60 mL分离胶 buffer pH8.81.90 mL1.85 mL共 7.5ml10% SDS0.1 mL0.10 mL1%过硫酸铵0.25 mL0.25 mLTEMED5 L5 L（最后加入以启动反应）浓缩胶30 %凝胶贮液0.7 mL水2.85 mL10%SDS0.1 mL浓缩胶 buffer1.2 mL共 5

28、 mL1 %过硫酸铵0.25 mLTEMED10 L（最后加入以启动反应）4. 样品的浓缩与脱盐：因实验2 亲和层析所得的纯化溶菌酶的蛋白浓度太低不利于电泳后染色，故先要对其进行如下浓缩：（注：本实验中的其它样品不必浓缩）1）取 a mL 样品（在本实验中用1.0 mL纯化的鸡蛋清溶菌酶） ，缓慢加入4a mL -20o C 预冷的丙酮 （边加边混匀），然后将其在 -20oC 静置 2h 以上。离心（ 10000rpm ， 10min ）后，弃上清（用吸管轻轻吸取上清），并将试管口倒扣于吸水纸上约半分钟以沥干溶液，沉淀于空气中干燥后备用。2）取适量样品裂解液（本实验中约用60 L）溶解沉淀 -

29、 用移液枪反复吸冲壁然后吸取至1.5mL 离心管中 沸水浴加热3-5min 离心备用（ 12000rpm ， 5min ）。3）本实验中的其它样品( 粗酶、酸和热变性酶)不必浓缩，按1： 1 加入样品裂解液（100 L酶液加100 L样品裂解液） ，100 加热处理5min离心后备用； 标准分子量蛋白100 加热处理3-5min 后，即可使用。5.上样向电泳槽中加上电极缓冲液，上接负极（黑），下接正极（红） 。用微量进样器在加样孔中点样。（上样量在 15-25 L间比较合适 ）6. 电泳：开始时用8 mA 电流，当溴酚蓝迁移至分离胶处后，改用10mA 电流。7. 染色、脱色：.取出凝胶平板（从

30、尾部撬出！以免弄烂玻璃板）切去浓缩胶或琼脂糖部分，于蒸馏水中漂洗3min ，如此重复2 次，浸于染色液中，不断振荡1-2hr ,脱色，半小时换一次脱色液。五、电泳结果分析1. 根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。2. 根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率，计算目的蛋白的分子量（以 lgM 对迁移率R 作图，其中M 为蛋白质分子量） 。123图 1 鸡蛋清溶菌酶的 SDS-PAGE图谱1.亲和层析后的鸡蛋清溶菌酶；2.低分子量标准蛋白；3.粗酶。其中标准分子量蛋白分别为：鸡蛋清溶菌酶（14.4KDa ）、胰蛋白酶抑制剂（20.1KDa）、牛碳酸酐酶 （ 31.0 KDa ）、兔肌动蛋白

31、（ 43.0 KDa ）、牛血清白蛋白（ 66.2 KDa ）、兔磷酸化酶B（ 97.4 KDa ）。.实验四、纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析一、目的了解各环境因素（如：温度、pH 值等）对酶稳定性的影响。了解衡量酶稳定性的指标：半衰期T1/2 。二、原理酶的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响而保持其活性的能力，酶的稳定性在生产应用上具有重要的意义。酶的稳定性常用半衰期（T1/2 ）来衡量，其表示一定条件下酶活力丧失50%所需的时间。一般来说半衰期越长表明酶在特定条件下的稳定性越好。溶菌酶的热失活行为可简化为不可逆的一级失活模型。以 E 和 D 分别表示活性酶与失活酶，则失活反应方程式可以表示为：

32、EK dDkr式中 Kd 和 Kr 分别表示正反应和逆反应的速度常数，因是不可逆失活反应，故Kr=0。令时间为 t 时活性酶的浓度为E t , 酶活性为At ，则有：d E tk d E tdt E tE0exp(k d t )ln E tlnE 0k d tlnAtlnA0k d tlnA0k d t .(1)AtT1/2ln 2.(2)k d根据式（ 1），以 lnA0 对处理时间 t作图其斜率即为kd 。进而通过式（ 2）便可求得半衰期（T 1/2 ）。At三、材料、试剂1. 材 料： 实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶、指形管等。2. 试剂和仪器： 0.5 mol/L NaOH ；

33、pH 计。四、实验步骤1.取亲和层析所得的纯化溶菌酶用蒸馏水稀释5 倍后 （此时溶菌酶所处的环境为酸性的醋酸溶液 ），分装入5 根指形管中，每管0.5mL ，放入75水浴中保温，分别处理0, 10, 20, 40, 60 min后取.出，在自来水下冷却，测定酶液的残留活力，以未经处理（即0 min ）的酶液活性为100%，计算其它加热处理酶液的相对活力，并以“相对活力 ”对 “加热处理时间”作图。2.同时取稀释后的纯化溶菌酶5mL,在 pH 计上用0.5 mol/LNaOH 将酶液的pH 值调至8.0 左右（此时溶菌酶所处的环境为中-偏碱性的溶液，此步调pH 值特别关键，避免过碱或过酸！），分

34、装入5根指形管中，每管0.5mL ，同步骤1 将其放入75 水浴中加热，处理0, 10, 20, 40， 60 min后，分别测定酶液的残留活力，做与上述同样的分析。五、实验结果与分析：1.观察加热处理中酶液的变化情况（如沉淀的出现）。2. 以 “相对活力 ”对 “加热处理时间 ”作图。3.以 ln A0 对处理时间t 作图，其斜率即为kd ，进而便可求得半衰期（T1/2 ）。At4.比较两者酶液热稳定性的差异，并分析环境pH 值条件对酶分子热稳定性影响的原因。六、注意事项1. 由于所得纯化酶的活力太高不便于活力的测定分析，故应将实验二所得的纯化酶作适当稀释（本实验约为 5 倍）后，再进行加热

35、处理试验。2.在步骤2 中，要确保酶液的pH 值被调至8.0 左右。.实验五、木瓜蛋白酶的制备一、目的学习和掌握有关酶源（本实验为木瓜乳汁）的选取、采集及粗酶提取等方面的基本原理和方法。二、原理木瓜又名番木瓜（Carica Papaya），多年生常绿大型草本植物，生长在南北纬32o 之间。木瓜蛋白酶则被广泛地应用于食品医药等行业，如：啤酒的澄清、饼干的膨松等，其大量存在于木瓜乳中。现有木瓜酶的生产上是以未成熟的木瓜果实为原料来采集木瓜乳。本实验以生长在植株上的木瓜果实为材料，通过划破果皮来采集新鲜的乳汁，进而用缓冲液抽提其中的蛋白酶，并分析其酶活性。三、材料、试剂和仪器1. 材料种植在网室中结

36、有果实的木瓜树、牙签、烧杯、离心管等。2. 试剂0.4mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2 ）： Na2HPO4·12H2O 103.14g ， NaH2 PO4 ·2H2 O17.5g ，溶解，定容至 1000mL。0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2 ）：将 0.4mol/L磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）稀释 4倍。1% 的酪蛋白溶液：称10g 的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2 ）配至1000 mL 。激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2 ）配制含半胱氨酸10 mmol/L, EDTA1mmol/L的混合液。即 2.423g 半胱氨酸，

37、 0.744gEDTA 溶解于 2L pH7.2 ，0.1mol/L磷酸缓冲液。10% 三氯乙酸（TCA）：称取100 g 的 TCA，定容到 1000mL 。3. 仪器： 分光光度计、离心机、 HZS-H 水浴振荡器、 Sartorius BP110S 电子天平。四、操作步骤1.木瓜乳的采集选取谢花坐果 60天以上的的木瓜果实， 用湿棉布小心檫净表面，而后用牙签，在果实的表面划若干条深约1-2mm的伤口，此时便有大量的白色乳汁流出，用培养皿接在底下收集，片刻后收集的乳汁便会凝固（若天气干燥可在割乳的前一天浇灌大量的水），称取所收集乳汁的重量。2.木瓜蛋白酶的抽提往上述凝固的木瓜乳中加适量的0

38、.1mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.2 ）在研钵中充分研磨，离心（10000rpm ， 10min ），取上清，量体积后放置备用。3. 酶活性的测定 ：先自定义酶活力单位（U）。（参照实验二中对酶活力单位的定义）样 品测 定步 骤（按从左到右的顺序进行）酶液10%TCA激活剂1% 的酪蛋摇匀10%TCA（ mL）（ mL ）（ mL ）35白（ mL ）35（ mL）过滤或离对照管0.111.9保温1反应0心，测定滤反应管（ 30.101.910min110min1液或上清的个）A275nm 值.4.蛋白含量的测定考马斯亮兰G-250 法，取 50 uL 的样品液加入2.5mL 的考马斯亮

39、兰G-250 溶液，摇匀，放置 5 min 后，在 595nm 波长下测定吸光度，并根据标准曲线 （酶样蛋白含量(mg/mL)= 1.674×595nmA - 0.0354 ）计算出蛋白含量。五、实验结果与分析1. 计算所得酶样的活力先要自定义酶活力单位（U）。 （参照实验二中酶活力单位的定义）酶液的活力（U / mL酶液）。酶液的蛋白含量（mg 蛋白/ mL ）。比活力（ U / mg蛋白）。2. 计算酶得率（ U / g 木瓜乳） 。六、注意事项1. 选取谢花坐果 60-100 天左右的木瓜果实（果皮青绿色）来采集木瓜乳。2. 不能将果实摘取下来后，再来划线采集木瓜乳。这是由于不

40、再有根压的存在，而导致无木瓜乳流出。3. 若天气过干旱，要在采乳前一天适当浇水。.实 验 六：壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶一、目的学习壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的方法、掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。二、原理甲壳素是由N-乙酰基 -D- 葡胺糖通过- (1,4)糖苷键联结的直链状多糖，甲壳素脱去分子中的乙酰基就转变成壳聚糖, 其基本组成基本单位是D-葡胺糖。壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物降解、无毒易得的天然功能高分子材料，被广泛用来作为固定化酶的载体。壳聚糖分子中D-葡胺糖的 -NH 2 可与双功能试剂戊二醛的一个-CHO 缩合，戊二醛的另一个-CHO 与酶的游离氨基缩合，从而形成壳聚糖-

41、 戊二醛- 酶 结构，即固定化酶。本实验采用以戊二醛为双功能试剂的载体交联法固定化木瓜蛋白酶。三、材料、试剂和仪器1. 材料 ：壳聚糖，木 瓜蛋 白 酶 液。2. 试剂 ：（ 1 ） 1% 的冰醋酸溶液；（ 2 ） 甲醛（ 37%）；（ 3 ）1mol/L NaOH；（ 4 ）0.8%的戊二醛（用磷酸缓 冲 液 配 制 ）： 量取 32mL的 25 戊二醛，稀释到1000mL ；（ 5 ）0.1mol / L磷 酸 缓 冲液 （ pH 7.2 ）（ 6 ）2 mol/L 的 NaOH3. 仪器 ：抽滤装置，恒温水浴震荡器，冰箱，摇床等。四、实验步骤1. 壳聚糖凝胶颗粒的制备称取 0.5 克壳聚

42、糖充分溶解于35 mL1% 的冰醋酸溶液中，加入3.0mL 甲醛（ 37%）迅速混匀，.在 40水浴中静置保温100 min , 得到透明的凝胶，加小量蒸馏水将凝胶挤压破碎，倒出并在研钵中进一步破碎成适当大小凝胶颗粒，接着在烧杯中使其悬浮于100mL 蒸馏水中， 不断地用2 mol/L的 NaOH将悬浮液的pH 值调至8.0 ，放置10min ，而后用蒸馏水在抽滤漏斗上洗涤凝胶颗粒数次，抽去多余水分，备用。2. 壳聚糖凝胶颗粒的活化取上述凝胶颗粒10 g ，加入 40mL 0.8% 的戊二醛， 室温放置100min ，用 0.1mol / L磷酸缓冲液 （ pH7.2 ）洗涤凝胶颗粒3-4 次

43、，以除去多余的戊二醛，抽滤备用。3.固定化往上述的凝胶颗粒中加入15mL 木瓜蛋白酶液，4下放置2h，中间搅动数次，而后用0.1mol / L磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）洗涤凝胶颗粒3-4 次，（注意：收集洗液，不要超过50mL ）以除去未固定的木瓜蛋白酶，即得固定化木瓜蛋白酶。4.酶活力测定首先要定义酶活性单位（U）。定义在当前测定条件下，使测定体系在275nm波长下的吸光度每分钟增加0.01 所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。（ 1）溶液酶活力测定与实验五的酶活性测定方法相同。（ 2）残留酶活力测定取 0.1mL 残留液测酶活。残留酶活力数（ U） A275/min收集液× 0.01× 0.）1 mL×V/ （ 10 min（ 3）固定化酶活力测定称取 0.1g 固定化酶，加入2mL 激活剂。其余步骤与溶液酶活性测定方法相同。五、数据处理及计算固定