血小板源生长因子对培养内皮细胞移行的影响及其与血管内皮细胞生长因子的关系

1、    血小板源生长因子对培养内皮细胞移行的影响及其 与血管内皮细胞生长因子的关系        一、材料与方法 1.材料与试剂：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）株（ECV304）由武汉大学菌种保存中心提供。PDGF-BB、DMEM/F12、胎牛血清(FBS)及青霉素-链霉素均为美国Gibco公司产品。血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗血清为Santa Cruz公司产品。PDGF-BB、SABC试剂盒抗血清及二氨基联苯胺(DAB)由博士德公司提供。2.血小板源生长因子

2、（PDGF）对培养HUVEC移行的影响：参照Gajdusek等1介绍的方法，并加以改进。选用生长良好的HUVEC悬液，调整细胞密度为2×104个/ml，接种于6孔培养板,其中放置一大小为0.2 cm×1.0 cm的盖玻片，加入生长培养液(90% DMEM/F1210 FBS)，37，5 CO2培养至融合状态(接种后24 h)，维持液(98 DMEM/F122 FBS)洗脱3次，培养48 h使细胞趋于静止。无菌取出盖玻片，常规、低氧或不同浓度PDGF条件继续培养，24 h后，用冰PBS快速洗涤3次，10%甲醛固定10 min。计数5个不同盖玻片视野细胞数目（10×）

3、。内皮细胞的低氧培养：采用Kuwabara等2介绍的方法并加以改进。主要步骤：常氧培养瓶中灌注99.99% N2，流量68 L/ml，持续4 min后塞注瓶口培养。3.免疫组织化学检查：采用SABC法，细胞培养方法大致同上，不同的是培养结束后无菌取出盖玻片；免疫组化检查参照试剂盒说明书。盖玻片用含1%的Triton的TBS溶液2037处理2 h，3 H2O2室温下处理510 min，蒸馏水洗2 min×3次，滴加封闭液，室温10 min，甩去多余液体，滴加适当稀释兔抗VEGF抗体，2037 12 h，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次。滴加羊抗兔抗体，2037

4、20 min，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，滴加试剂SABC，2037 20 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×4次。DAB显色，蒸馏水洗涤。封片、照相，IBAS型像处理系统吸光度扫描。4.统计学处理：所有数据均以均数±标准差（±s）表示，两两样本均数比较用t检验。二、结果1.PDGF对于培养内皮细胞移行的影响：在培养板中放置盖玻片，向培养基中给予不同浓度PDGF前取出盖玻片，显微镜下可见HUVEC向盖玻片区移行，给予不同浓度PDGF 24 h后计数盖玻片上细胞数目，结果显示：低浓度PDGF对培养HUVEC盖玻片细胞数目

5、无明显影响PDGF 5 ng/ml组为（96±13）个/pv，对照组为（87±5）个/pv，P>0.05；高浓度PDGF（10、20 ng/ml）能显著增加培养HUVEC盖玻片上细胞数目分别为（178±22）、（294±16）个/pv ，P<0.001，PDGF浓度为20 ng/ml时引起的盖玻片上细胞数目的增加显著大于PDGF浓度为10 ng/ml时(P<0.01)。由于盖玻片上细胞数目可以在一定程度上反映培养HUVEC的移行能力，大剂量PDGF能增加盖玻片上细胞数目，说明PDGF能够刺激培养HUVEC移行。显微镜下计数低氧培养条件下

6、盖玻片上HUVEC数目，结果显示：低氧培养条件盖玻片上HUVEC数目显著下降低氧组为（52±4）个/ pv，对照组为（87±5）个/pv，P<0.01，HUVEC移行受抑制；不同浓度PDGF均能增加低氧培养条件盖玻片上细胞数目低氧加PDGF 5、10、20 ng/ ml组分别为（64±9）、（123±11）、（197±15）个/pv，但仅后两组与单纯低氧培养相比，盖玻片上细胞数目显著增加（P<0.001），而且PDGF剂量越大，增加的细胞数目越多（P<0.01）；小剂量PDGF与单纯低氧培养相比，盖玻片上细胞数目增加无显著性差

7、异（P>0.05）。由此可见，大剂量PDGF能拮抗低氧对HUVEC移行的抑制作用。2.PDGF对于培养内皮细胞VEGF表达的影响：用 SABC试剂盒及DAB显色试剂盒检测的HUVEC VEGF阳性胞质呈棕黄色。像处理系统测得的平均吸光度结果显示：低浓度PDGF对培养HUVEC平均吸光度值无明显影响（PDGF 5 ng/ml组为0.231±0.012，对照组为0.224±0.021，P>0.05）；高浓度PDGF能显著增加培养HUVEC平均吸光度值（PDGF 20 ng/ml组为0.291±0.024，P<0.001）。由于吸光度值与培养细胞VEG

8、F表达强弱成正比，表明大剂量PDGF可显著增加培养HUVEC VEGF的表达。与常规培养相比，低氧培养时通过免疫组化方法测定的HUVEC平均吸光度值显著上升（低氧组为0.323±0.025，对照组为0.224±0.021，P<0.001）；缺氧培养基中加入不同浓度的PDGF均可进一步增加HUVEC平均吸光度值（低氧加PDGF 5、20 ng/ml组分别为0.329±0.018、0.379±0.011），但PDGF浓度为5 ng/ml时细胞平均吸光度值与单纯缺氧培养相比差异无显著性（P<0.05），PDGF浓度为20 ng/ml时HUVEC平均

9、吸光度值与单纯缺氧培养相比显著升高（P<0.001)。研究结果说明低氧培养条件下HUVEC VEGF表达增强，大剂量PDGF能够增强低氧条件对于培养HUVEC VEGF表达的影响。三、讨论1.PDGF对于培养内皮细胞移行的影响：PDGF具有促血管再生作用，在损伤修复、动脉粥样硬化和肿瘤形成以及中枢神经系统发育中起重要作用。以往的众多移行实验多采用“擦刮法”，本研究改进在培养板中放置盖玻片，在外源因素干预前无菌取出盖玻片，最后计数盖玻片上细胞数目，以评价HUVEC移行。结果表明：低浓度PDGF（5 ng/ml）不影响培养HUVEC移行，高浓度PDGF（10、20 ng/ml）能显著刺激培养

10、HUVEC移行，盖玻片上细胞数目与PDGF浓度正相关。我们用不同的移行实验证实低氧可抑制培养内皮细胞的移行，同时证实PDGF可拮抗低氧对HUVEC移行的抑制作用，拮抗强度与PDGF剂量呈正比。5 ng/ml PDGF对低氧培养内皮细胞移行无显著增强作用。2VEGF在血管新生中的作用：VEGF是一种特异性的作用于内皮细胞，与血管生长最为直接的生长因子。无论在胚胎发育、创伤修复等生理情况下，还是在炎症、视网膜病变和肿瘤生长等病理情况下，VEGF都与血管的发生和生长有密切关系。VEGF主要通过促进内皮细胞、平滑肌细胞增生，刺激内皮细胞表达胶原酶，及作为渗透因子增加细胞迁移，从而使新生血管形成。3PD

11、GF对血管组织VEGF水平的影响：大量研究表明在体内环境，多种体液或物理因素均可直接、间接通过增加组织VEGF水平，从而刺激内皮细胞的生长，促进新生血管的形成。我们观察了正常氧、低氧培养条件下，PDGF对于培养HUVEC内VEGF表达的影响。结果表明：无论正常氧或低氧培养条件下，PDGF均能增加HUVEC VEGF表达，且呈剂量依赖性，小剂量作用不显著；低氧培养条件下HUVEC VEGF表达增强。在增加HUVEC VEGF表达方面，PDGF和低氧有显著的协同作用。（本文编辑：常秀青）基金项目：湖北省九五攻关项目(96291101)作者单位：夏豪（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内

12、科）黄从新（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内科）李庚山（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内科）李建军（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内科）尹丽娅（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内科）王晶（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内科）参考文献1，Gajdusek CM, Luo Z, Mayberg MR. Basic fibroblast growth factor and transforming growth factor beta-1:synergistic mediators of angiogenesis in vitro. J Cell Physiol，1993，157: 133-144. 2，Kuwabara K, Ogawa S, Matsumoto M, et al. Hypoxia-mediated induction of acidic/basic