羊痘病毒及其疫苗研究进展.docx

1、幼物2010.31(4),7781ProgreKHinVeterinaryMedicine羊痘病毒及其疫苗研究进展赵忠荀点，矢国华。翩析敏'，张强'(1.中国农业科学院兰州停医研究所家俗佼病病旅生物学国家柬点实脸室农业部备腐病存学重点开放实验室,甘肃兰州730046,2.甘雨农业大学动物氏学院，什雨兰州730070)摘要：国内外已时羊痕病畚及对*痕的预防控制做了大受的研究工作。¥痘痛毒的流行病学特征、分离及体外培恭、体外检测已有了枝快的发展,而其致痛机制和基因蛆姑构、分子衣位、馅构蛋由及麻姑构殳血等分子生物学特征的研究尚待逐浙批入更加深入的稀究.近年来的研咒主奏是奸对

2、站构基因如p32的各臭找体的构建、表达和对非饴构思因如TK基因的研究及其缺失栽体的杓建、】RT的功能研究等等。会面而深入的分子生物学和免疫学丞础的研究.将为发展更为有效的检测珍断方法，并为安会有效的亚单位疫苗、受组疫苗及枇酸疫苗的研制奠定基命。关键询；羊痛病毒，毒力相关其因及蛋白TR基因及分子诊断，疫苗申图分类号；幽52,654文献标炽码；A文SWI#：1007-5038(2010)04-0077-05收稿日期|2009-10-15基金项目：甘肃省科技重大寺顼计划硕目(O92NKDAO32)作者简介；必志苟(1984-),男(白栋).贵州人.硕去研完生，主婆从事前物痛去分子生物学学鸟允秋防治研

3、完.*通讯作者RNAiandItsApplicationonTreatmentofAnimalVirusDiseasesDUBin.HANLi-mei.ZHANGLeHei.LITiandai<ShenytmuAur'iculiuratUnivanUyShtnyang»Liaaning*1)0161.China)AbstrwctiRNAiisbeingwidelyused心anefficientgenesilencinKmethodduetoitsspecificitynndefficiency,EndogenousRNAiplnysanimportHnlroleinn

4、ntivirtilimmunityinplants.nemfltodvsandinsects,WhileinnuimmwlH.ititstilluncertainwhethertherearevirusspecificsiRNAandprotectiveRNAidefensesys-tem,loplemadeeffortstosetupnnefficaciouslyantiviralsysteminmammalianH.gainedmanyremarkableachievenieniH.Hndestablishedhnewpathforthepreventionandtrefttmentofv

5、irnldiseases.ThemechanismofRNAianditsapplientioninontivirnldiseasesinanimalwerereviewed.KeywordsiRNAinierferenceianimaliviraldisenae羊痘！W尚(upripfhrvirus.CPV)是最重要的动物痘阴毒在分类地位上属于痘病毒科(Paruiridae)样椎动物痘病毒业科(Oiordopo.rrimif)中的羊痘病毒属(QipripaErus)成员，包括山羊痘病毒(Goatpax-viruatGPV)»绵羊痘病毒(Sheep/>arvirus§

6、PV)和牛姑背疹病毒(iMf/ipyskindiseasevirus.LS-DV)。作为山羊痘、绵羊痘和牛结节疹耕的致痛因子.CPV能引起这些动物最为严重的疾病孔在非洲、中东，中亚以及印度,SPV、GPV对小反刍兽产生r极大影响,在这个些地方它们的流行常常导致易慰动物很高的发病书和死亡卒f而相fi.LSDV限于非洲大陆和马达加斯加存在，而且牛的纳节性疹块典发枕率不定，死亡率低最近几十年.科研人员对CPV进行了大鼠:研究,许多实脸室都做了大量工作，试图通过一步步深入的研究,能够控制、消灭羊痘。随着CPV基因组的公布，儿年的时间内，大M文献报道了CPV研究情况.文章就CPV的分子生物学以及其相关疫

7、苗的研究进展做一踪述.1病毒基本特征CPV为卵圆形或砖形病寿，胞浆内复制.共琪因组是双饶D、A,其大小约为290nmX27Onm.CPV由1个核、2个侧体和2层脂质外膜组成，属于较小的痘病毒病毒粒子。CPV的衣壳有囊膜，囊膜内含有病毒特异性蛋白。核是由DNA和蛋白质组成的核蛋白复合体，位于病毒粒子的中央，呈两面凹陷，凹陷内分布有2个侧体。核和侧体一起由脂蛋白性表面膜包围，其间充填有可溶性蛋白，一层栅栏状的核心膜紧贴于核心周围。CPV对干燥有较强的抵抗力.在干燥的痂皮内可存活3个月6个月，在干燥羊舍内可存活6个月8个月反复冻融对其没有明显的灭活作用，但对直射阳光、常用消毒药以及乙酰或氯仿敏感，放

8、线菌素-D和漠脂氧尿苜可抑制病毒复制。CPV可在牛、绵羊、山羊源的组织培养细胞上生长，原代、次代羔羊睾丸细胞和肾细胞最为敏感，也可用Ver。细胞等细胞系对CPV进行培养。CPV接种细胞后最早可在感染后4d使少量细胞出现细胞病变，之后的4d6d细胞病变迅速扩展到整个细胞层。观察是否有CPE出现最多可达14d。2CPV的基因组结构CPV基因组较大，由143kb147kb碱基组成,A+T含地约为75%。CPV含有147个开放阅读框(openingreadframe,ORF),编码密度约为93%,能够编码53个2027个氨基酸。CPV的基因组由中间编码区和两端相同的反向末端重复序列(invertedt

9、erminalrepeatJTR)构成。中间编码区(ORFs024123)是一个与痘苗病毒(Vaccineavirus,VV)基因的所有保守基因同源的核心编码区域，其左侧和右侧的1027kb的基因结构中包含有重要的编码功能的基因序列，含有基因编码病毒复制的必需因子其参与病毒转录、RNA修正、病毒DNA复制、病毒粒子的构建和装配等。两端ITR(ORFsOOl023,ORFsl24156)长度均约为2.3kb,保守性较低.但含有一些功能基因家族，与病毒感染的宿主范围、毒力等将性有关。这些基因家族包含5个ankyrin基因重复序列和3个kelch基因重复序列，还有一些细胞因子结合蛋白、IL10、表皮

10、生长因子样蛋白、PKP抑制因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、痘病毒特异性毒力基因等的同源序列，它们编码的蛋白质与病毒的修饰、病谭在宿主细胞中的逃逸、细胞凋亡以及免疫应答等有关"刃。ITR最末端是两条链交叉连接的发卡环，紧接着是由两套独特序列隔开的串联重复序列。SP-PV的ITR上的串联重复序列大小为46bp,LSDV的为5bp,而在GTPV的ITR上则不存在串联重复序列。3CPV毒力相关基因及蛋白研究概况3.1P32基因及其编码蛋白3.1.1p32基因p32基因位于CPV基因组的6465kbp处，由第74号()RF编码，是CPV基因组的长3.7kbp、PstI片段的一部分。HindDI、Ps

11、tJ片段含有5个ORF,分别与VV的J6R、H1L、H2L、H3L、H4L基因同源，即P32基因与编码位于胞内成熟VV病毒粒子表面的p35蛋白的基因具有同源性。SPPV、GTPV的p32基因的阅读框分别由323.322个氯基酸组成，分别由972bp、969bp的碱基编码。它们在基因组成上高度保守，在核昔酸水平和氨基酸水平上分别有97.5%和94.7%的同源性皿。两者P32基因最主要的区别是在SPPV的P32序列中的55位处是天冬氨酸，而在GTPV和LSDV中不存在。GTPV和SPPV的P32基因有两个&oRV酶切位点，而在LSDV中则没有EcoRV酶切位点的存在。3.1.2结构蛋白p3

12、2p32蛋白是从CPV感染细胞中分离得到的结构蛋白，分子质量为32ku°此蛋白为CPV的各毒株所共有且含有重要的抗原决定簇，它能够刺激豚鼠迅速产生抗CPV的中和抗体。p32蛋白是CPV的囊膜蛋白，由319个324个氨基酸组成，具有跨膜的螺旋结构，该结构位于C端287位307位氨基酸处。现已证实p32蛋白是羊痘病毒属特有的蛋白，存在于所有已分离的CPV毒株中，其单一血清可以中和CPV感染早期产生的抗体。因此P32基因可作为羊痘PCR诊断的目的基因。3.1.3P32基因克隆、表达及应用p32蛋白是目前世界各地分离、鉴定的CPV共有且特异很强的结构蛋白。获得可溶性的P32蛋白是进行CPV抗

13、体检测以及进行亚单位疫苗研制的前提条件。因此到目前为止，基于P32结构蛋白进行的克隆、表达已相当多。国内外研究人员已构建了各种各样的连接载体和表达载体，也取得了不同程度的成果。早在1994年,ChandP等利用大肠埃希菌表达了谷胱U肽S转移酶融合和多聚组氨酸融合的重组P32蛋白，并以该重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法，而且证明了重组蛋白与正痘病毒和副痘病毒阳性血清均没有反应。全长P32蛋白可溶性最大，且在ELISA中的反应性最好。近年来，国内不少研究人员扩增了P32基因，克隆至不同载体，并分别在原核和真核细胞中表达了有一定活性的目的蛋白。但由于P32蛋白的跨膜区对细胞具有毒性作用，使其表

14、达氐低，很难纯化到重组P32蛋白以”。于是.国内外研究者便以截去跨膜区的P32基因为研究对象，研究其重组蛋白的用途。Chand'，等曾用截去跨膜区的重组p32蛋白为抗原，研究了检测抗体的间接ELISA方法，该法快速、可靠，且没有传染性。但是最近的研究结果表明，全长P32蛋白截去跨膜区后，对其免疫原性有一定的影响3.2非结构基因及相关基因3.2.1TK基因的研究多种DNA病毒具有胸腺喧嚏核甘激醵基因(TK基因)编码的胸腺啥嚏核存激酶。CPV的TK基因位于基因组中部ORF66处，距离两端的ITR分别为52kb和91kb。TK基因编码174个氨基酸的多肽，这些多肽与VV的J2R基因编码多肽的

15、同源性约66%。在痘病毒科中不同属的痘病毒TK基因的位置不同.在CPV.VV、鸡痘病毒(Fowlpoxvirus.FPV)中TK基因分别位于基因组的3个不同的位置。AmanoH等猜测，这种位置的不固定性很可能是在痘病毒进化过程中，由于痘病毒的基因组重排造成的。尽管存在位置不固定，但TK基因均位于基因组的中间区域而且具有较高的保守性。CPV拥有庞大的基因组和许多非必需区，具有研究基因缺失疫苗和病毒活载体的巨大潜力。TK基因是CPV的主要毒力基因，也是病毒复制的非必需基因，缺失TK基因的CPV突变株在细胞中的复制能力极大减弱，因而使疫苗更安全。目前国内外已有不少关于TK基因重组病毒的构建。Bhan

16、uprakashV等口们利用TK基史作为非必需区构建了重组CPV。郭巍等i克隆了我国山羊痘弱毒疫苗(GTPV-TY)的TK基因，并利用同源重组构建了带有同源重组曾和筛选标记的转移载体。郑敏5通过试验研究获得一株性状稳定并保持形态、生长性能和免疫原性不变，但对山羊致病力降低的TK基因缺陷毒株；其整个试验结果还证实了GTPV的scrpin蛋白可通过抑制caspase-8活性而抑制细胞凋亡。不过，目前GTPV缺失疫苗和活载体的研究依然处于起步阶段。但是卜.述研究无疑也将会对活载体缺失疫苗的研制进一步奠定基础。3.2.21TR基因及其在CPV分子诊断中的应用目前，国内应用PCR方法检测CPV主要是针对

17、P32蛋白基因，但是针对p32蛋白基因检测往往也存在不足.而对于同一样本针对ITR基因片段进行扩增，能够较容易的检测出病毒的存在。因此，有人便基于ITR基因片段进行研究，试图另外找到可应用PCR方法检测的更为保守、敏感的CPV的基因片段。ManganaVO等顷用CPV的KS-1株和InS-1株的ITR为为目的基因设计引物建立了鉴别SSPV的简单、快速、特异的PCR方法，能将SPPV与GTPV和疱疹病毒(Herpesviruses)区分开；Markoula-tosP等“a用ITR和a微管蛋巾为目的基因设计引物，建立了检测皮肤组织中的SPPV和羊传染性脓疱病毒(Contagiousecthymav

18、irus,CEV)的多重PCR技术，该技术采用3对引物、一步扩增方法，比用单一引物的PCR方法更快、更敏感。徐春志等:和王开功等分别应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向ITR片段，并将其克隆至PMD18-T载体，构建了重组质粒PMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5a感受态细胞进行培芥，对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定。徐春志等将所得序列与Gen-Bank收录的2株山羊病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果所测4个毒株序列与GenBank上收录的GTPV的该片段核昔酸序列的同源性均100%，与SSPV的该片段核曹酸序列的同源性均为98.3%。王开

19、功等研究也表明，4株病毒都可得到一条长度均为289bp的DNA片段，该片段可被内切酶AZ”I特异识另L而旦该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。与此同时，罗阿东等根据CPV的ITR的核甘酸序列设计引物，以CPV的DNA为模板，建立并优化了SYBRGreenI模式荧光PCR检测GPV的ITR基因的方法，并与普通PCR方法进行敏感性比较。结果表明，建立的检测GPV的SYBRGreenI荧光PCR方法能检测出7X102拷贝数的DNA模板比文献报道的普通PCR法更敏感、准确、快速。他们的研究结果均表明，ITR基因片段在羊痘病毒属中也很保守，可以针对ITR基因建立CPV的PCR检测方法。4CP

20、V分子检测目前国内基于CPV不同的基因建立了不同的分子检测方法，但是每个方法都不是完美的。如建立在P32基因的PCR方法，以及最近BalamuruganV等:侦构建的荧光定量:PCR方法均各自有不同的不足。而尽管基于重组P32建立的ELISA方法具有高度的特异性且与正痘病毒和副痘病毒没有交叉反应，但由于全长P32表达量低，很难得以推广使用。因此国内外不少研究人员K26）正研究CPV的其他特异性强、表达量高的功能基因，试图建立出cPv的诊断检测的新途径。5疫苗研制、CPV传统疫苗'国内外科研人员通过广泛使用许多CPV毒株作为活疫苗，成功制备了二十多种灭活或弱毒疫苗。有的免疫后保护力可长达

21、1年以上.有的甚至终生免疫。我国使用的疫苗主要是1958年沈荣显等将分离得到的GTPV太原株经过鸡胚化致弱而制成的弱毒疫苗，其免疫期可达1年。而灭活苗往往只能提供暂时性的保护，因为以组织培养细胞制备的灭活疫苗的病毒粒子不具备完糖囊膜，接种动物后不能有效刺激机体产生对带有完整囊膜的病毒粒子的免疫力。而且灭活疫苗通常不能有效激活细胞免疫，而CPV的免疫反应则主要是细胞免疫。所以灭活苗的效果常常不是很好。而旦活疫苗在非疫区使用时存在有病毒扩散的可能，所以尚需科研人员对CPV疫苗做进一步研究，期望在深入了解CPV的毒性和宿主范围的基因基础上，能够增加疫苗设计的有效性和多功能性。5.1 CPV亚单位疫苗

22、P32蛋白是目前世界各地分离、鉴定的所有CPV共有且特异很强的结构蛋白，但是要获得基于P32的CPV亚单位疫苗,必须先得到町溶性的P32蛋白。CarnVM等曾研究了大肠埃希菌表达的GST融合重组p32蛋白混合弗氏佐剂对试验山羊进行肌肉注射接种，并对重组蛋白的保护性进行了研究。试验结果证明将GSTP32配以佐剂接种山羊可以提高病毒中和抗体水平，降低CPV强毒感染.引起的临床症状。虽然不能阻止病毒在攻毒部位的复制，但是可以阻止病毒向周围的扩散，并旦使动物对病毒的反应更加敏感。但是在由于P32蛋白在表达的过程中会出现表达量低、表达不稳定等问题，这就在一定程度E制约着P32蛋白开发成亚单位疫苗的应用前

23、景。因此在CPV中寻找到免疫原性更好、表达量更大、表达更稳定的基因是十分重要的。5.2 CPV基因缺失疫苗CPV的宿主范围专一，仅感染山羊、绵羊和牛这类反刍动物，因此更具有用作载体研制活载体疫苗的优势。使用基因工程技术去除CPV的毒力相关的特定基因或基因片段可进-步获得的缺失疫苗。目前大多数研究者都试图通过缺失TK基因来实现。如王芳等构建TK基因缺失重组病毒以为获得能区分自然感染和疫苗免疫的基因工程标记疫苗，郭巍等将LacZ基因表达盒插入TK基因缺失转移载体筛选了TK基因缺失的GTP-VTY突变株。但是截至目前仍没有正式使用CPV缺失疫苗进行免疫预防CPV的报道。随着分子生物学的发展，人们对C

24、PV的认识逐渐深入。在基因组结构与功能、基因定位和基因表达调控等方面的研究不断取得进展，这也将对研发更为有效安全的基因工程疫苗奠定基础。6结论随着分子生物学迅速发展，目前对CPV的研究已经逐渐更为全面而深入。在以P32蛋白为研究热点以外，展开对CPV其他特异性强、表达量高的基因的深入研究2526.29.3。,将为更进一步解析病毒的功能提供依据。CPV毒力相关基因和决定宿主范围的基因的鉴定以及其特性的研究，将会为全面理解宿主与病原之间的相互作用，为获得新的更有效更特异检测诊断方法以及重组疫苗的研制提供新的途径。而对羊痘病毒更多复制非必需片段的筛选及更为有效的CPV载体的构建，也必将为反刍兽的传染

25、病和其他动物疾病的控制产生深远的影响。参考文献：匚DialloA.ViljoenGJ.MercerAA.ctal.GenusPoxvirusescapripoxvirusM.Birkhauser.Basci,2007:167-181.2JDflmonfK.KnipeDM,HowleyPM.etnl.FiedsvirologyMJ.LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,2007,2947-2975.3 BabiukS.BowdenTR,BoyleDB.ctal.Capripoxvirus：anemergingworldwidethreattosh

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