鸭坦布苏病毒病防治关键技术研究及应用医学专业

1、 鸭坦布苏病毒病防治关键技术研究及应用Key technology research and application of duck tembusu virus disease control目 录摘 要VAbstractVI缩略词表I第一章 综述21鸭坦布苏病毒病22病原学22.1生物学分类22.2形态结构及理化培养特性23鸭坦布苏病毒病的主要流行病学特征24江西省蛋鸭场鸭坦布苏病毒病流行概况35鸭坦布苏病毒诊断方法45.1 临床诊断45.2实验室诊断方法45.2.1病原检测45.2.2免疫组化方法55.2.3间接免疫突光试验55.2.4酶联免疫吸附试验6第二章 研究的目的及意义7第三章 材

2、料与方法81 材料81.1实验动物及病料来源81.2主要试剂81.3菌株与细胞81.4常用试剂及缓冲液配制81.5主要仪器81.6分析软件及说明92病原分离鉴定实验92.1样品采集92.1.1 样品背景调查92.1.2 样品采集102.2病原分离102.2.1病毒提取分离102.2.2引物设计102.2.3病毒RNA提取及第一链合成112.2.4全基因扩增与克隆112.3基因测序113病毒复制试验123.1病毒增殖培养123.2病毒含量测定123.3实验分组及攻毒123.4攻毒效果评价124病毒传播途径探究试验134.1病毒增殖培养134.2实验分组及方法134.3实验效果评价135鸭坦布苏病

3、毒防治试验135.1毒株、疫苗来源135.2中草药配制135.3实验分组及方法145.4实验效果评价146流行病学调查及田间应用试验156.1调查与应用试验范围156.2开展方式156.3实验效果评价15第四章 实验结果161病原分离鉴定实验161.1PCR结果161.2 序列比对结果172病毒复制试验182.1临床结果192.2PCR检测结果193病毒传播途径探究试验193.1临床结果193.2病理剖检结果204鸭坦布苏病毒防治试验214.1试验后产蛋变化结果214. 2致死率结果214. 3 剖检病理变化结果225流行病学调查及田间应用试验245.1流调结果245.2田间应用结果256 结

4、论与讨论26参考文献28致 谢32摘 要鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu virus disease, DTMUVD）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋大幅下降为主要特征的急性、烈性传染病。自2010年4月起，鸭坦布苏病毒病（DTMUVD）在我国部分地区相继暴发，在江西、安徽、河南、福建、广东、河北、山东、江苏、浙江、广西等地部分鸭场均有过报道，该病病程约为 12个月，会引起蛋鸭产蛋大幅下降，耐过的种鸭群可逐渐恢复产蛋，但淘汰率一般在10%30%之间，给养鸭业造成了严重的经济损失1-6。近些年以来，该病的发病率虽然出现降低趋势，但

5、是仍然存在高效防治措施不多、疫病暴发的原因尚未明确、动物回归的试验开展难度较大、疫病传播的途径不够详实等问题，为该病防控带来了巨大的挑战。本文旨在运用我省自主分离纯化的流行毒株进行病毒复制试验及防治研究，确定我省蛋鸭减蛋症致病原因，系统运用中草药制剂对当前鸭坦布苏病毒病防治效果进行研究，确定最优防治鸭坦布苏病毒病的药物组方，获得药效学和安全性分析基础数据，以期为开展好该病的防控提供科学性的建议与指导。研究的具体结果包括：一、鸭坦布苏病毒病病原学、生物学特性研究1. 通过病毒复制实验，结果证明实验成功复制鸭坦布苏病毒病，经病毒分离、基因序列测定分析表明，其病原为黄病毒科黄病毒属的坦布苏病；鸭坦布

6、苏病毒病不仅具有致病性，且是独立的病毒种类，具有可复制性，且在感染机体内能够稳定存在。2.通过鸭坦布苏病毒病传播实验，结果证明鸭坦布苏病毒病不仅具有致病性，且能够通过混群接触感染、空气传播等方式进行传播，在日常生产过程中对患病鸭群应尽早实行较好的隔离措施等方式，才能阻止疫病的传播。二、鸭坦布苏病毒病临床研究3.通过鸭坦布苏病毒过预防用药与攻毒实验，结果证明本试验所选用F疫苗和中草药1组、2组配方均能很好地控制鸭坦布苏病毒对鸭群产蛋的危害，能够显著地增强鸭群抵抗力，减轻卵巢的损伤，缩短恢复产蛋的时间；但是中草药1组配方在治疗时没能很好的控制蛋鸭死亡，鸭群死亡率为3.33%。疫苗是预防该病发生与防

7、控的较好选择，中草药在预防该病防控与治疗中有一定效果，但用法、用量及生产效益比等仍需进一步深入研究。关键词：鸭坦布苏病毒病，中草药，生物学特性，疫病传播，疫病防控AbstractDuck tembusu virus disease (DTMUVD) is an acute and strong infectious disease caused by Duck Tembusu virus (DTMUV).Since April 2010, temple Sue duck tembusuvirus disease (DTMUVD) outbreaks in parts of our countr

8、y and in jiangxi, anhui, henan, fujian, guangdong, hebei, shandong, jiangsu, zhejiang, guangxi and other places of YaChang were reported, and the disease course of about 1 2 months, can lead to a significant decline in egg production pathogenies, resistant to the kinds of ducks can gradually restore

9、 the eggs, but selective, generally between 10% 30%, supplies series caused serious economic losses1-6. In recent years, although the incidence of the disease appeared to reduce the trend, but there are still few effective prevention and control measures, the cause of the disease outbreak is not yet

10、 clear, animal regression test is difficult, the spread of the epidemic approaches such problems as insufficient, brought a huge challenge for the disease control and prevention.The purpose of this paper is to use our province autonomous purification of pandemic strain for prevention and control of

11、viral replication test and research, determine the pathogenies egg disease causes reduction in our province, the system use of Chinese herbal medicine preparation for the current duck temple Sue virus disease prevention and control effect are studied, determining the optimal drug prevention and cont

12、rol of duck temple Sue virus disease characteristics, basis of pharmacodynamics and safety analysis data, in order to carry out well the prevention and control of the disease to provide scientific advice and guidance. Specific results of the study include:1. Study on the etiology and biological char

13、acteristics of duck tambusu virus disease.1. Through the viral replication experiment results show that the experiment successfully copied duck temple Sue virus disease, after the virus separation, determination of gene sequence analysis showed that the pathogen of yellow virus flavivirus genus temp

14、le Sue disease; It is not only pathogenic, but also independent virus species, which is reproducible and can be stable in the infected organism.2. Through the temple Sue duck viral disease transmission experiment, the results show that the duck temple Sue not only has the pathogenic virus disease, i

15、nfection, and can be mixed group of contact in the form of air and spread, in daily production process for sick ducks good isolation measures shall come into force as soon as possible, to prevent the spread of the disease.Ii. Clinical study of duck tembusu virus disease.3. Through the duck temple Su

16、e virus prevention drug and poison attack experiment, the results prove that this experiment chooses F vaccine and Chinese herbal medicine formula 1 group, 2 group were well controlled duck temple Sue virus ducks to the harm of egg production, can significantly enhance ducks resistance, reduce ovari

17、an lesions, shorten the recovery time of egg; However, the formula of 1 group of Chinese herbal medicine failed to control the death of the duck, and the death rate was 3.33%. Vaccine is a good choice for prevention of the disease occurrence and prevention and control, Chinese herbal medicine in the

18、 prevention of the disease control and prevention and treatment has a certain effect, but the usage, dosage and the production efficiency ratio still needs further research.Key words: duck tembusu virus disease, Chinese herbal medicine, biological characteristics, epidemic disease transmission, epid

19、emic prevention and control.7缩略词表Abbreviations Table英文缩写英文全称中文名称minhSMLbpkDaELISAMinuteHourSecondMilliliterBase pairKilodaltonEnzyme-linked imMunosorbent assay分钟小时秒毫升碱基对千道尔顿酶联免疫吸附试验DTMUVDuck Tembusu virus鸭坦布苏病毒IHCImmuno-Histochemistry免疫组织化学DTMUVDDuck Tembusu virus disease鸭坦布苏病毒病第一章 综述1鸭坦布苏病毒病鸭坦布苏病毒病

20、（Duck Tembusu virus disease, DTMUVD）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）引起的一种急性、烈性传染病，以蛋鸭产蛋大幅下降为主要特征的。该病的流行特点表现为发病急、传播速度快、发病率高等，会导致蛋鸭产蛋迅速下降甚至停产。发病前期主要表现为持续高热，发病鸭群后期会出现一定比例的神经症状，临床表现为瘫痪、翻滚、站立不稳及共济失调。该病发病率可高达100%，但病死率较低，约为5151-6。2病原学2.1生物学分类在分类学上，鸭坦布苏病毒(DTMUV)归属于黄病毒科（Flaviviridae）的黄病毒属（Flavivirus）中恩塔亚病

21、毒群（Ntaya virus group）的坦布苏病毒（Tembusu virus）7-8。 2.2形态结构及理化培养特性鸭坦布苏病毒（DTMUV）具有典型的黄病毒形态特征，病毒粒子呈现球形状，表面有纤突和囊膜，直径约为50nm。该病毒不耐热，对乙醚和氯仿较为敏感9；该病毒不具备血凝活性，无法凝集鸡、鸭、鹅、鹤、人、鼠、猪、兔等的红细胞。鸭坦布该苏病毒（DTMUV）增殖载体较多，在鸭胚、鸡胚、Vero 细胞和鸭胚成纤维细胞中均可以增殖，主要在感染细胞的胞浆内复制10。鸭坦布该苏病毒经尿囊腔接种鸭胚 35d 后死亡，表现为绒毛尿囊膜增厚、水肿，胚体水肿、出血，表现为折光性增强，细胞变圆及融合，最

22、终崩解死亡11-13。2.3基因结构鸭坦布苏病毒（DTMUV）具有黄病毒典型的基因组特征，是单股正链的RNA病毒，有衣壳。病毒基因组全长10,990 nt，基因组顺序为5'-UTR-C-pr M/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5 -UTR-3'。开放阅读框为10278nt， 5'端及3'端的非编码区长度分别为94nt和618nt28-32。外膜蛋白E上连续7个氨基酸的抗原区域主要集中在20-400位氨基酸，分别为：E25-33，E52-74，E79-88，E118-127，E148-161，E166-174，E178-186，E21

23、5-230，E243-252，E261-270，E285-292，E313-319，E 351-357，E388-398。在E蛋白的103-105位和154-156位存在两个糖基化位点（分别为NGC和NYS）34-43。3鸭坦布苏病毒病的主要流行病学特征黄病毒属大多数病毒危害较大，是一种可引起脑炎、脊髓炎、明显的神经症状的人畜共患、自然疫源性疾病的病毒，比如登革热病毒、脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒等9,33。鸭坦布苏病毒（DTMUV）也不例外，站立不稳，卧地不起等神经症状在鸭感染后该病毒都均有表现，但除此之外，该病毒与其他黄病毒属病毒不同的是地方还表现于该病毒可致蛋鸭卵巢病变，从而导致产蛋

24、下降14-20。DTMUV几乎可感染所有品种的鸭，尤其是对麻鸭的致病力最强，易感染群主要以产蛋鸭群为主，现也有在鸡、种鹅和野鸭体内也分离到该病毒的报道，可见其致病范围之广21-29。本病的流行病学的确切研究目前尚未看见报道，但从临床角度来看，如果鸭舍中一栏鸭发病后，疫病扩展到整栋鸭舍时间只需要1-2天内，同一地区的其他鸭场一周之内即可蔓延到达13，通过开展动物实验来验证，与病鸭同居可感染发病，由此推断出，水平传播为该病毒的主要传播方式，尤其是经过呼吸道的传播，动物的采食及饮水也有可能传播该病6,14。因为黄病毒属大部分成员的传播方式为蚊虫传播，所以DTMUV经虫媒传播的可能性也存在。但根据有关

25、数据显示，在北方地区在秋冬季节，蚊虫活动相对较少，但仍然有DTMUVD大面积的流行的情况，而且白蛉和蚊虫的飞行距离较为有限，这与该疫情可以在短时间内大范围暴发的情况不大相符。目前尚无蚊子体内病毒的分离和动物回归试验报道，且病毒传播期间的温度变化与其他节肢动物传播的其他黄病毒的发病时间也不一致，所以目前该病毒不一定是以节肢动物为主要传播媒介，一些鸟类也有可能是传播媒介9,15。赵冬敏等16发现该病毒在种鹅中可通过鹅胚传到下一代，说明该病毒可经垂直传播。4江西省蛋鸭场鸭坦布苏病毒病流行概况在上世纪90年代，就有DTMUVD发生的报道，1997年，一种疑似黄病毒的有囊膜病毒被温立斌等17从石家庄、邢

26、台等地出现产蛋下降、神经症状的康贝尔鸭子中分离到，初步命名为“鸭病毒性脑炎”。从2010年开始，仅仅几个月的时间，该病就在我国突然大规模爆发，席卷了我国绝大多数养鸭地区。随后，相继报道了种鸭和蛋鸭产蛋下降的病例，并从病例中分离到一种黄病毒。从发病种鸭中分离出了一种新型黄病毒，命名为BYD病毒。起初，该病有多种命名，鸭病毒性脑炎、鸭出血性卵巢炎、鸭黄病毒感染、如鸭产蛋下降综合症、鸭坦布苏病毒感染等均被使用过。经过大量的研究发现，导致鸭群发病的这种黄病毒在进化关系上，与1955年从马来西亚库蚊中分离到的坦布苏病毒非常相近19。因此，该病名称于2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将统一

27、，命名为“鸭坦布苏病毒病”。2010年，DTMUVD被报道传入江西省，给江西省养鸭业造成了巨大经济损失。自2015年9月份以来，江西省大多数蛋鸭养殖集中区相继出现产蛋鸭产蛋率突然大幅下降的情况，该疫病在乐平市、鄱阳县、弋阳县、新建区、丰城市、宜丰县等地均有爆发。通过对发病群体的临床症状、剖检观察、病毒分离、基因测序和动物回归试验等技术手段，确定了该病的致病原因是DTMUV19。2016年35月，笔者对江西省蛋鸭养殖密集区进行了大量调查，先后到九江、吉安、南昌、鹰潭、景德镇等5个地市的20个养殖场（其中包括了3个发病场），共采集血清和棉拭子样品524份，对采集的样品进行荧光定量RT-PCR检测。

28、通过实地调查和实验室检测，结果显示鸭坦布苏病毒感染率较高，鸭坦布苏病毒感染在3个发病场（其中包括1个鹅发病场）均被检测出；20个被调查的养殖场中，有18个场检测出DTMUV阳性，养殖场带毒率高达90%。5鸭坦布苏病毒诊断方法5.1 临床诊断产蛋鸭感染DTMUV的主要临床表现为釆食量大幅下降，严重时甚至出现食欲废绝现象，产蛋率亦随之急剧下降，可由产蛋高峰期的90%95%在短期内下降至5%10%。该病的发病率高达100%，而且感染后该病的死淘率达到了5%15%，继发感染时鸭群死淘率可达30%40-44。流行初期病鸭会出现体温升高、排绿色稀粪的临床症状，后期神经症状表现更加明显，会出现头颈抽搐、共济

29、失调的情况，双腿向后伸展，甚至瘫痪，严重病鸭会导致死亡。病鸭所产种蛋受精率会受到较大影响，受精率会降低10%左右。该病病程一般为11.5个月，可自行逐渐恢复45。体质好的鸭群，尤其是刚开产或产蛋高峰期的鸭群，产蛋率一般可以恢复到发病前的产蛋水平。蛋鸭在感染该病后，恢复后期多数会出现一个明显的换羽过程。商品肉鸭和育成期的种鸭发病后临床症状表现以神经症状为主，表现站立不稳、倒地不起、行走不稳，发病期一般在2040日龄，病鸭有饮欲和食欲，但多数会出现饮水、釆食困难的情况，因此病鸭容易因进水进食困难而衰竭死亡，死淘率为10%30%45-47。5.2实验室诊断方法5.2.1病原检测5.2.1.1电镜法在

30、实验室诊断方式中，一般可根据病毒本身具有的形态、结构和大小等不同的特征，利用电镜技术进行直观、准确地病毒鉴别，此诊断方法较为直观。用DTMUV感染DF-1细胞72h后，2.5戊二酵固定，制作超薄的病理切片，通过电镜观察，发现该病毒有球形、有囊膜、有纤突的病毒粒子，病毒粒子直径大约50nm47-50。该方法虽然能直观地观察到病原体，但需要专业技术人员才能操作，操作步骤也比较繁琐，且该检测法对病毒量有较高的要求，所以不能用于快速诊断。5.2.1.2 病毒分离病毒分离接种法经常用于分离检测活的病毒，是一种较为传统且经典的病毒检测技术。感染DTMUV的病鸭适宜分离病毒的部位有卵泡膜、脑、脾脏、肝脏等病

31、变组织，其中最易分离和检测到病毒的是卵泡膜和卵巢中。DTMUV在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero细胞中初次分离的成功率仅为20.6，低于临床样品RT-PCR检出率46-52。乳鼠脑内接种法和细胞接种分离法是病毒分离常用的两种方法，将病料研磨处理后，乳鼠脑内接种一定数量的DTMUV，观察散窝、弓背、震颤、抽搐、甚至死亡等情况是否会在乳鼠身上出现，以此来判断其是否感染。同时，可以根据发病鼠数量测定病毒的滴度。细胞接种分离法，受限于有的黄病毒产生的细胞病变不明显，难以区别和判断，所以分离阳性率低。在实际操作中，接种分离法经常免疫组织化学、免疫焚光、焚光定量RT-PCR等方法结使用，以此来相互印证

32、，一般不单独应用。无论是乳鼠脑内接种法还是细胞接种分离法，均有实验周期长，操作繁琐等缺点，特别是当结果为阴性时，需要进行盲传代，以排除由于病毒量少而导致假阴性结果的可能性53-69。5.2.2免疫组化方法免疫组织化学（Immuno-histochemistry ,IHC）又称免疫细胞化学,简称免疫组化，IHC是组织化学的分支，其是在组织化学的基础上逐渐发展起来的。为了实现对细胞或组织内的相应抗原进行定性、定位或定量检测的目的，需要借助突光或细胞化学的手段，以抗体作为特异性染色的载体，将一些物质标记在抗体分子上，使抗原抗体复合物能够在显微镜下直接观察，其原理是利用抗原与抗体特异性结合的特点。随着

33、免疫组织化学技术的出现和发展，传统的病理学也发生了一场翻天覆地的革命，使得纯形态的病理学逐渐发展成为了现代病理学，它包括了形态与免疫信号两部分。对鸭群进行人工鸭坦布苏病毒攻毒后，取攻毒感染鸭的主要组织脏器，制作切片后进行免疫组织化学分析，结果在肾脏、脑、脾脏、肺脏等器官中均有黄色棕染颗粒，而明显的阳性信号在对照组中没有发现，这表明，鸭坦布苏病毒存在于这些组织脏器中20,21。5.2.3间接免疫突光试验间接免疫突光试验是病毒感染快速诊断的一个重要手段，简便、特异性强、非特异性的突光染色少是间接免疫突光试验的最大优点。间接免疫突光试验利用的基本原理是将突光素与某些特异性抗体或抗原以共价键结合，但共

34、价键的结合不影响该抗体的特异性，然后用此突光素标记的抗体对标本染色，只要标本中有相应的抗原，则突光标记的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，在紫外光或激光的照射下，复合物中的劳光素发焚光，借助劳光显微镜能观察到该抗原的定位情况。该方法的缺点体现在敏感度低，而且每检测抗原与突光抗体需要一一对应，每次检测都需要重新制备突光抗体，比较麻烦。检出病毒抗原需要用病变的组织作成冰冻切片或触片作为间接免疫突光，而且该方法检测黄病毒需要病毒特异的单克隆抗体20,22,23。5.2.4酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验检测方法是通过IgM捕捉ELISA的方法，随着酶联免疫吸附试验检测方法的出现，在很多时候，血凝抑制试验、补体结合试验和中和试验等检测方法都被其取而代之。基于此种检测方法操作要求较低，在市场上得到了较高的认可，具有广泛的应用前景。目前，我国对黄病毒的诊断研究的过程中，大多数都热衷于研究