结核分枝杆菌H37Rv的β-内酰胺酶假说的分子克隆,超表达和生物化学的特征

1、结核分枝杆菌H37Rv的-内酰胺酶假说的分子克隆，超表达和生物 化学的特征K.M. Nampoothiri, R. Rubex*, A.K. Patel*, S.S. Narayanan, S. Krishna, S.M. Das and A. Pandey印度,生物技术部，国家学科科学与技术学会（以前的区域研究实验室），CSIR杂志名称：Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072影响因子：2.09 摘要目的：分子克隆，和来自于结核分枝杆菌H37Rv基因组的基因的超表达与生物学特征与-内酰胺酶的活性有关。方法和结果：对结核分枝杆菌H37Rv基因

2、组的分析表明，Rv2068c，Rv0406c和Rv3677c基因产物进行了预测，表现出-内酰胺酶的活性。这三个基因都用pET28a载体克隆然后在C41(DE3)大肠埃希菌细胞中进行过量表达。加标记的重组蛋白被免疫印记法证实重组成功，同时通过对头孢硝噻和其他的-内酰胺类抗生素的水解反应证实这些重组蛋白质具有-内酰胺酶活性。所有重组蛋白的催化参数均由酶的抑制试验所得出。用于重组菌株的抗生素敏感性试验显示其对不同种类的-内酰胺类抗生素抵抗性的增加。结论：研究表明在结核分枝杆菌中可能有不止一个基因编码具有-内酰胺酶活性或类似-内酰胺酶活性的基因，因此使得结核分枝杆菌可以广泛抵抗-内酰胺类抗生素。这篇研

3、究的重要性和影响性：系统化的关于结核分枝杆菌-内酰胺酶的假设研究，和相关的种类及-内酰胺类抗生素的抑制试验可以对于发展新的针对肺结核引起的多重耐药的药物抵抗菌株治疗的新的抗生素很有帮助。关键词：-内酰胺酶，-内酰胺类抗生素，结核分枝杆菌，头孢硝噻前言：分枝杆菌菌株对于抗分枝杆菌药物的抵抗性的增加和结核病在现在的死灰复燃都强调了寻找新的治疗结核病手段是非常迫切的。-内酰胺类抗生素可以抑制细菌中的转肽酶反应和阻止细菌细胞壁的合成，所以是非常广泛的抗微生物制剂。然而大多数分支杆菌是天然抵抗-内酰胺类抗生素，大概是因为它们的非常疏水的细胞壁，虽然其细胞质中存在青霉素结合蛋白但重要的是它同时存在-内酰胺

4、酶催化水解-内酰胺类抗生素的作用。大多数的结核分枝杆菌产生-内酰胺酶，在酶的结构上，分类上有不同，以及是否分泌细胞质或者绑定细胞膜和关于是否其产物是可诱导或是构成的。对分枝杆菌-内酰胺酶的动力学研究大多与酶制剂不纯有关，或者与已推断间接的关于-内酰胺类抗生素和-内酰胺酶抑制剂的合成物的药敏试验结果有关。系统的研究结核分枝杆菌-内酰胺酶和与其相关的种类，还有对于相应的-内酰胺类抗生素及其抑制剂的药物敏感性实验的研究，有利于对新的抗生素制剂的发展。来自结核分枝杆菌H37Rv的DNA文库的粘粒上的开放阅读框架和已知的A类-内酰胺酶具有同源性，该基因从结核分枝杆菌的染色体上的DNA用PCR扩增出来，而

5、且被Vloadri用大肠埃希菌中高表达。重组酶的动力学与直接用pI是5.1和4.9从结核分枝杆菌中提取出来的-内酰胺酶相似，该重组酶主要表现出青霉素酶的活性。事实上，作者也提出了第二个可能性，即一小部分的-内酰胺酶也具有相对较强的的头孢菌素酶活性。有相关报道说无毒的结核分枝杆菌H37Ra的主要的-内酰胺酶Bla A基因与Rv2068c中的BlaC基因的生物化学结构完全相同。在耻垢分枝杆菌中的主要的-内酰胺酶基因（Bla S/Bla A,Bla E)与偶发分枝杆菌中的A级分枝杆菌中的Bla F基因生物化学特征相似。这个结构说明Bla C具有成为用-内酰胺类药物和-内酰胺酶抑制剂的混合剂治疗结核的

6、潜在的作用靶点。对于分支杆菌中-内酰胺酶的详细分布和精确的特征是迫切需要阐述的，以便用于评估未来在治疗肺结核中-内酰胺类药物的作用角色。很少有临床证据表明，-内酰胺类抗生素与-内酰胺酶抑制剂组合，如阿莫西林-克拉维酸，氨苄西林-舒巴坦，该组合在结核分枝杆菌感染的治疗过程起作用。结核分枝杆菌基因组序列测定的完成，已经打开了通向治疗结核病的新的途径。这篇研究说明了存在有不止两种的蛋白质，除了BlaC，在结核分枝杆菌H37Rv菌株中有类似于-内酰胺酶活性的蛋白质存在，提供了抵抗-内酰胺类抗生素的抗普性。材料和方法：菌株，化学药品和试剂pET28a载体从USA，Novagen获得，然后在从USA，Av

7、idis获得大肠杆菌C41(DE3)的表达体系中表达。克隆的步骤在大肠杆菌Top 10细胞中进行，该细胞来源于UK在泰恩河上的纽卡斯尔大学。结核分枝杆菌H37Rv菌株中的染色体DNA来自USA，科罗拉多州大学，而且是在研究材料转移的协议书的基础下进行的。PCR克隆试剂盒，小量制备试剂盒QIAprep，QIAquick凝胶提取试剂盒和他的抗体试剂盒均购自Qiagen公司，德国。限制性内切酶，T4DNA连接酶和DNA聚合酶是从新英格兰BioLabs公司和美国MBI Fermentas公司获得。相关蛋白纯化柱获得于GE医疗保健（Amersham公司）。抗鼠IgG抗体，对位硝基氯化四氮唑/ 5溴- 4

8、 -氯-3吲哚磷酸（NBT / BCIP）用于免疫检测，均来自于美国Sigma公司。寡居核苷酸引物来自于印度的Bangalore Genie公司。头孢硝噻基片来自于UK牛津大学。-内酰胺类抗生素和普通的分子生物学级别的化学用品在本研究中使用，均购自于美国Sigma公司，默克公司，和印度Hi公司。质粒和DNA制备所有的DNA制备均遵照标准协议，就像Sambrook等人描述的一样。结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv2068c（blaC），Rv0406c（-内酰胺酶样蛋白）和Rv3677c（可能是水解酶）的克隆所有这三个基因，都是用结核分枝杆菌H37Rv基因组中的DNA进行的PCR扩增得来的。用来扩增

9、Rv2068c，Rv0406c，Rv3677c的引物分别是，FPblaC5'GAT CGA TCC ATA TGC GCA ACA GAG GAT TCG3'（包括一个Nde 1限制位点，重点标注）和RP blaC5'GAT CGA TCG CGG CCG CCT ATG CAA GCA CAG CGG CAA3'（包括一个Not 1限制位点，重点标注），FP blp5'CAT AAA AAT GAA TTC CAT ATG GTC GCG ACC CGC GGC（包括一个Nde 1限制位点，重点标注）和RP blp 5'GCC CCC CCC

10、GAA TTC TAA CTA CCG AAA TAC ATG ATT 3'（包括一个EcoRI限制位点，重点标注），FP ph5' TTC CCG GCC GAA TTC CAT ATG TCG AAG ACA GCT GAG 3'（包括Nde 1限制位点，重点标注）和RP ph 5' CCG CTC GAG GAA TTC TAA CTA CCG AGT CCG CAG ATA 3'（包括一个EcoRI限制位点，重点标注）。为了证实PCR产物，被扩增的产物（blaC 924 bp,-内酰胺酶样蛋白819bp和类似水解酶795bp）在Genei Pvt

11、 Ltd,Bangalore被测序。PCR产物被纯化，被各自的消化酶消化，然后再用各自的酶导入表达载体pET 28a中形成重组质粒pET28a:blaC，pET28a:Rv0406c和pET28a:Rv3677c.合成质粒在通过电穿孔转化到大肠埃希菌C41（DE3）中。超表达，复兴和纯化过夜培养的大肠埃希菌C41(DE3)携带有质粒pET28a:blaC，pET28a:Rv 0406和pET28a:Rv3677c接种于200ml的LB肉汤培养基，其中加有30g ml-1卡那霉素，然后在37 200转每分的摇床中培养，直到光密度（OD600)达到O.6-0.7.该基因的表达由1mmol-1异丙基

12、-D 半乳糖硫吡喃糖苷类（IPTG）3.5小时在37诱导。细胞在离心速度在5009g在4中分离出。将沉淀的细胞再悬浮于10ml的裂解缓冲液，其中包括20mmol-1磷酸盐缓冲液（PH 7.4），500mmol-1NaCl，5mmol-1咪唑，蛋白酶抑制剂所组成的混合试剂（德国，Roche）和6mmol-1-巯基乙醇。细胞用56%振幅的超声处理（Sonics，USA）进行破坏，进行10s开10s关的一共持续7分钟的冰下脉冲。该裂解物在4，11270g的转速下离心15分钟，从而分离出可溶蛋白。清澈的上清液和沉淀分别用12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测表达情况，这表明大多数结合蛋白是在相应的细胞

13、颗粒中的细胞膜中发现的。沉淀物在用1%的Triton X-100洗涤两次然后再悬浮于提取缓冲液中，其中含有3mol-1尿素，500mmol l-1NaCl，20mmol l-1的磷酸盐缓冲液中（PH 7.4）和6mmol l-1-巯基乙醇，然后放入冰下1小时，再在4的条件下离心15分钟，离心速度是11270g。蛋白质的复性用Ni-NTA柱。尿素中的蛋白质样本装上1ml Ni-affinity His-trap柱。装上之后，该柱用五个柱的容积的缓冲液洗涤，其中含有20mmol l-1的磷酸盐缓冲液（pH 7.4），500mmol l-1NaCl,6mmol l-1-巯基乙醇和5mmol l-1咪

14、唑。重组蛋白质被含有500mmol l-1的NaCl和20mmol l-1磷酸盐缓冲液（pH 7.4）还有梯度的咪唑（50-500mmol l-1）洗涤然后用1ml碎片被收集。另外，重新折叠的蛋白质，含有尿素组份的重组蛋白质被复性缓冲液（20mmol-1磷酸盐缓冲液 pH7.4，500mmol-1 NaCl和1mol l-1精氨酸）稀释到0.1mg ml-1的浓缩蛋白，混合均匀然后保存在4环境中1个小时。精氨酸逐步用20mmol l-1的磷酸盐缓冲液稀释，pH7.4，精氨酸的浓度从1到0 mol l-1在4。复性蛋白进一步稀释使用磷酸盐缓冲液（pH 7.4），其中包含1mg ml-1BSA，然

15、后一直保持到70，直到使用。这两种方法都用于三种蛋白质。测定蛋白浓度和-内酰胺酶的活性对于不同种样本中蛋白质浓度的测定是用Bradford's方法（Bradford 1976）用牛血清蛋白作为标准。头孢硝噻吩的显色反应（Oxoid）被用来测定-内酰胺酶的活性。该方法测定进行于30 100mmol l-1头孢硝噻的20mmol l-1的磷酸盐缓冲液中，pH 7.4。检测486nm水解使用UV分光光度计（Shimadzu,Japan）和记录10分钟内不超过30s的吸光度。Nitrocefine每个蛋白质水解率用每微克头孢硝噻每分钟水解每微克蛋白表示。SDS-PAGE电泳和蛋白印迹法酶制剂的

16、纯度检测每一步都需要运行12%的SDS-PAGE电泳。纯化蛋白被装上12%的SDS-PAGE凝胶电泳，并电泳转移到Immobilon-P的转移膜上。在用3%的牛血清白蛋白封闭后该膜再用TBS吐温/海卫缓冲剂冲洗两次。该印迹在anti-His主要抗体溶液中（1:1000稀释度）放于常温中1小时。该膜再用IgG与碱性磷酸酶结合的次级抗体（1:5000稀释度）处理之前，用TBS和TBS吐温/海卫缓冲剂冲洗。免疫反应用颜色测定，用NBT/BCIP作为底物。最后，该印迹用蒸馏水清洗和风干。动态测定动力学参数是观察头孢硝噻在486nm起始水解率（英国的牛津，剑桥），波长对应最大改变吸收率在没有水解底物和水

17、解的产物之间。所有的动力学实验都是在30下20mmol l-1的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中进行。蛋白提取液被含有1mg ml-1BSA的磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.1mg ml-1，用来防止酶的变性和为水解实验做好准备。除非它有另外的指定，对于BlaC，5g l-1蛋白 用来测定另外两种蛋白，10g l-1已经用过。每个底物酶合成物的Vmax和Km都从1/V到1/s绘图（利-伯氏标绘图），线性的Michaels-Menton方程，用电脑化软件（Hyper32;生物化学部门，利物浦大学，英国和Graph Pad prism 5）抗菌敏感性最小抑菌浓度（MIC）是用无菌的96孔微量滴定板，其中

18、加入微小肉汤稀释液。C41（DE3）大肠埃希菌细胞携带相应的重组质粒pET28a用于这三种基因的研究。重组的大肠埃希菌细胞在LB肉汤（OD600值是0.6）被IPTG诱导。像阿莫西林，阿莫西林-克拉维酸，氨苄西林，头孢噻啶，头孢噻肟和头孢唑啉的抗生素浓度在0.25-128g ml-1作为最小抑菌浓度实验的浓度范围。重组株的高度的-内酰胺类抗生素抵抗也说明用一个不同的方法在18小时培养重组株接种（0.5%v/v）在50ml LB培养基其中含有卡那霉素（30g ml-1）上，放入250ml锥形瓶当OD600到达0.7时，加入1mmoll-1IPTG进行诱导,在诱导后30分钟，像阿莫西林（ 5 0g

19、 ml-1），头孢噻啶（50g ml-1）和卞青霉素（75g ml-1）等抗生素分别的加入然后细胞生长超过6个小时后加入其他抗生素，用OD值在600nm进行检测。6个小时后在等分LB平板上活菌数也要检测。抑制试验酶和抑制剂在30的环境下放在一起5分钟，然后它的水解率用100mmol l-1的头孢硝噻作为底物测定。酶的失活与不同浓度的-内酰胺酶抑制剂（0.25-100g ml-1)一起研究。Ki值用头孢硝噻作为底物测定。酶被加入一个混合有抑制剂和头孢硝噻，其吸光度的变化在486nm进行测定。-内酰胺酶抑制剂的浓度需要减少超过50%的头孢硝噻的水解率，被定义为IC50。除了直接测定卞青霉素，卞青霉

20、素的Km值是由Ki决定的，Ki是用来假定竞争性抑制是的值，其中底物是头孢硝噻。结果表达和纯化在IPTG诱导和细胞破碎后，认为大多数的表达蛋白仍然保留在沉淀里，然后可以用含有3mol-1尿素的缓冲剂提取出来，然后在含有Ni2+NTA-His的柱中纯化与图中1b相似。大多数的重组蛋白被含有150mmol l-1的咪唑洗脱成碎片。三种蛋白在纯化和复性后的产出率是在120-150mg l-1的范围内。按照氨基酸序列，计算BlaC的分子量，-内酰胺酶样类蛋白和可能的水解酶的大小分别是32.56，29.22和28.48kDa。考虑到加入His标记，蛋白质条带中含有SDS-PAGE，分子量可能发生微小的变化

21、。重组蛋白用Western印迹抗体His标记抗体进行进一步的证实。（重组蛋白的超表达，纯化和确认。a.12%SDS-PAGE显示在3mol-1尿素提取物中的超表达蛋白。1纵是BlaC蛋白；2纵是-内酰胺酶类蛋白；3纵是可能的水解酶；4纵是分子量标准。b 12%SDS-PAGE显示在通过His trap Ni2+亲和层析柱后的蛋白质纯化情况。1纵是蛋白的比较标准；2纵是BlaC蛋白；3纵是-内酰胺酶类蛋白；4纵是可能的水解酶。c 用抗His抗体进行的重组蛋白的免疫检测的蛋白印迹结果。1纵是BlaC蛋白；2纵是-内酰胺酶类蛋白；3纵是可能是水解酶；4纵是预染的蛋白标记。)动力学研究BlaC的动力学

22、参数，用头孢硝噻和卞青霉素作为底物，被呈现在表1中。（Ki对于EDTA表示为mol-1，对于克拉维酸+阿莫西林表示gml-1）BlaC的Km和催化效率（Kcat/Km）用卞青霉素做底物，其值分别是500mol-1和0.174mol-1。Kcat/Km的值与曾经的报道比较，当时BlaC的Kcat/Km的值是0.293mol-1s-1,用氨苄西林做底物。BlaC在用头孢硝噻，和显色的头孢菌素做底物时的Kcat/km值是0.418mol-1s-1，与底物是卞青霉素时的Kcat/Km的值比较高出2.4倍，说明BlaC对于头孢硝噻比卞青霉素有更多的特异性。内酰胺酶类似蛋白对于卞青霉素的亲和性（Kcat/

23、Km=0.0266mol-1s-1)比对于头孢硝噻的亲和性（Kcat/Km=0,0163mol-1s-1）要稍高一些。可能的水解蛋白的Kcat/Km值，在用头孢硝噻做底物时是0.0216mol-1s-1，比用青霉素做底物（0.00641mol-1s-1）高出3.3倍（如表2）。一般而言，BlaC蛋白对于卞青霉素和头孢硝噻的亲和力比内酰胺酶类似蛋白和类似水解酶对其亲和性的要高。内酰胺酶类似蛋白显示出对青霉素和头孢硝噻等同的亲和性，而可能水解酶显示出对头孢硝噻更高的亲和性，但是两者的催化效率都很低。（表1和2）。结果说明BlaC显示出青霉素酶和头孢菌素酶活性，其也是结核分枝杆菌中的内酰胺酶的主要成

24、分，其他两种酶只占极小的部分。抑制试验是用克拉维酸和阿莫西林的组合还有EDTA对三种蛋白质完成的，而且显示出克拉维酸和阿莫西林对于BlaC在Ki值是1.49gml-1（表1）时是比较有效的。作为商用的克拉维酸/阿莫西林混合物的摩尔比率没有提到，Ki是用mol-1替代g ml-1。内酰胺酶类似蛋白和可能性的水解酶的水解活性完全被低浓度的克拉维酸/阿莫西林（<2.5g ml-1）组合物所抑制。数据表明克拉维酸对于BlaC蛋白具有很弱的抑制性，而对于另外两种蛋白却是完全的抑制。这个发现支持早些的报道，该抑制研究说明克拉维酸对于结核分枝杆菌的BlaC（Ki=2.4g ml-1）蛋白有相对弱的抑制

25、性，比TEM-1高出24倍。EDTA对于三种蛋白质具有非常弱的抑制性，其对BlaC的Ki值计算为1280mol-1，对于内酰胺酶类似蛋白的值是2280mol-1，对于可能性的水解酶的值是2230mol-1（表1和2），因此表明这些酶都不是金属酶。这些也与前面关于结核分枝杆菌的BlaC的报道一致，那里提到Y49酶不被EDTA所抑制即使其浓度达到100mmol l-1。（Ki在表达EDTA时用mol-1表达，在表达克拉维酸和阿莫西林时gml-1。ND表示没在本实验中提过）易感性实验在不同方法例如纸片扩散法试图分析三种混合株易感性实验，满意的结果是从微肉汤稀释法获得的。五种不同的内酰胺类抗生素的MI

26、C值就是用此方法测定的，结果在表3中表示。每个抗生素浓度测试像之前提到的，方法是药物敏感性实验对于每种抗生素，用在检测重组细胞中的生长状况。除了头孢噻肟，其他的抗生素，重组株显示出更好的抵抗，最大抵抗值能达到8gml-1对于头孢噻啶。与其他两个重组体相比，C41（DE3）大肠埃希菌细胞中的质粒pET28a:blaC显示出轻微的抵抗羧苄西林，羧苄西林属于青霉素中carboxpenicllin的亚群。头孢噻肟，第三代头孢菌素，控制和重组体都没显示出任何生长迹象，甚至浓度在2.5gml-1。在放入内酰胺类抗生素烧瓶试验中，所有的三个重组体均表现出肉眼可见的生长。对于C41（DE3）株显示一个迹象，即

27、在装有卞青霉素中生长6个小时后减少，而且这个减少对于在起始阶段有阿莫西林和头孢噻啶的减少更明显（图2）。在卞青霉素作用6个小时后，有生命力的细胞数在控制株是5.5×108，重组株是1.4×109到1.9×109。在这三种情况中，内酰胺类抗生素抵抗由于内酰胺类抗生素被重组酶水解。（各种-内酰胺类抗生素的对于大肠埃希菌重组体表达结核分枝杆菌中的BlaC，-内酰胺酶样蛋白和可能性的水解酶的最小抑菌浓度MIC。C41（DE3）带有pET28a载体作为标准株。1-标准株；2-BlaC重组株；3-内酰胺酶类似蛋白的重组株；4-可能的水解酶的重组株）讨论几种土壤中的细菌物种产生

28、-内酰胺类物质，也许是作为抵抗其他细菌的武器（虽然这还存在争议）。在进化的时期，敏感细菌对-内酰胺类物质产生-内酰胺酶作为抵抗。-内酰胺酶的产生也许是最为常见的呼吸道病原体。总的来说，82%的粘膜炎莫拉菌隔离群产生-内酰胺酶，18.1%的Heamophilus流感和89%的金黄色葡萄球菌株产生-内酰胺酶。结核分枝杆菌也是呼吸道病原体，也继承有这种产生-内酰胺酶的能力，从而更适于在这个环境下生存。分支杆菌普遍抵抗-内酰胺类抗生素是主要因为-内酰胺酶的存在。作为备用治疗，-内酰胺类抗生素和-内酰胺酶抑制剂的混合制品成为有效的作用于体外结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌等。克服-内酰胺酶水解是对于-内酰胺类

29、抗生素起到效果的主要挑战任务，因此对结核分枝杆菌中的-内酰胺酶的认识是至关重要的。在结核分枝杆菌H37Rv中的BlaC蛋白是由Rv2068c编码，被认为是与抵抗-内酰胺类抗生素防御机制中最起到最主要作用的-内酰胺酶蛋白质。该蛋白质发现有许多地方与真菌的-内酰胺酶相似。保守结构域揭示BlaC与Pen P蛋白有相似性，来自于蛋白菌伯霍尔德杆菌的A类-内酰胺酶和来自棍状杆菌属的催化水解羧酯酶，它们的结构与C级-内酰胺酶蛋白和其他PBP相似。从序列，预测在N末端有原核脂质接触位点（Prosite PS51257）和-内酰胺酶 A的活动位点（Prosite PS00146）。一般说来，C级-内酰胺酶家族

30、，是丝氨酸-内酰胺酶家族。-内酰胺酶类似蛋白是被结核分枝杆菌H37Rv的Rv0406c编码的蛋白，它的基因组序列有多于70%的相似度与草分枝杆菌比较，麻风分支杆菌和鸟分支杆菌有少于50%的相似度与来自于麦芽黄单胞菌中的类似于-内酰胺酶 L1前体蛋白比较。在我们研究中的第三种基因，可能的水解酶是由基因Rv3677c编码，有将近82%的序列与麻风分分枝杆菌相似，55%与天蓝色链球菌的类似水解酶相似。将近有35%与来自于新月柄杆菌中的金属-内酰胺酶家族蛋白相似，还有一些其他的Proteobacterium相似。结果显示-内酰胺酶类似蛋白和可能性的水解酶的保守区都与GloB的基因序列相似，它是Zn依赖

31、的水解酶来自蛋白酶鼠疫耶尔森菌，Clavibacter michiganensis的金属-内酰胺酶超家族，中间耶尔森菌的-内酰胺酶家族中类的金属依赖的水解酶，大肠埃希菌中-内酰胺酶家族中类的金属依赖的水解酶等。Expasy Prosite的扫描与-内酰胺酶样蛋白和可能性的水解酶的基因序列没有显示出有关-内酰胺酶活性或脂质附件的特征序列。对于可能性水解酶的分子量改变比起SDS-PAGE可能更归功于不规则偏移在凝胶上，可以因为某些氨基酸残基的高的出现率当报道某些结核分枝杆菌和其他一些细菌蛋白，或者因为一些蛋白清洁剂复合物的罕见的形状或者是低度的SDS绑定到蛋白上，就像报道的Actinomadura

32、 R39-内酰胺酶一样。关于水解的研究揭示了BlaC有青霉素酶和头孢菌素酶的活性。最近，Wang等人报道了BlaC有很宽的范围特异性，对于青霉素酶和头孢菌素酶的活性是相等的。-内酰胺酶的某些氨基酸取代，像Arg244，Asn276，Arg275，Met69，Met182和Tro165被报道过，它们增加对于克拉维酸的抵抗性，这些置换揭示了结核分枝杆菌的BlaC的晶体结构。也有一种假设，关于BlaC的广泛的底物特异性是因为它的灵活的底物结合位点，它可以适应不同类型的底物。也有早期报道，在缺失blaC基因的结核分枝杆菌中，其对-内酰胺类抗生素的敏感性增加，从8到256，这也显示了blaC在结核分枝杆菌中的主要作用。事实上，当用-内酰胺酶抑制剂和抗结合的乙胺丁醇结合物作用时，多重耐药的结核分枝杆菌的-内酰胺酶的MIC值比0.5mg ml-1小。（图2 -内酰胺类抗生素抵抗在培养基上，用重组的大肠埃希菌表达结核分枝杆菌蛋白，表现出-内酰胺酶的活性。A.阿莫西林抵抗50g ml-1。b.头孢噻啶抵抗50g ml-1。c.卞青霉素75g ml-1。代表重组的大肠埃希菌表达的结核分枝杆菌的H37Rv的可能性水解酶。代表