脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖合成及相关基因的研究进展.docx

1、综述.脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖合成及相关基因的研究进展于飞飞综述；应莲芳，张海红审校兰州生物品研究所有限责任公司中试研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心，H.肃兰州730046摘要:脑膜炎奈瑟菌(Neisseriamemngilules,Nm)是流行性脑脊跳膜炎的主要致病菌荚膜多糖(Capsularpolysaccharides,CPS)是该倘主要的致病因子。近年来，随着基因组与分子生物学的不断发展.CPS合成相关基因越来越受到关注。重点对NmCPS的合成及相关基因作用作一综述。关键词:脑膜炎奈瑟萌;英膜多糖;合成;基因中图分类号：R378.1*5文献标志码：A文章编号：1005-5673(2016)

2、04-0048-06DOI：10.13309/ki.pmi.2016.04.011ProgressinsynthesisandrelevantgeneofNeisseriameningitidiscapsularpolysaccharidesYUFei-fei,YlNGLian-fang.ZHANGHai-hongPilotPhinlTestLaboratory,hinzhouInstituleofBiologicalProductsCo.,Lld.,CenterforGtmsuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuPr

3、ovince,ChinaCorrespondingauthor:YINGLian-fang,E-mail:yinglfl965Abstract:Neisseriameningitides(Nm),amajorpathogenofepidemiccerebrospinalmeningitidis,containsandexpressesacapsularpolysaccharides(CPS)thatisaprimarypathogenicfactor.Recently,withthedevelopmentofgenomicsandmolecularbiology,牌geneforCPSsynt

4、hesishasattractedmoreandmoreattention.ThisreviewfocusedonthesynthesisandrelevantgeneofNmCPS.Keywords:Neisseriameningitidis；Capsularpolysaccharides；Synthesis；Gene脑膜炎奈瑟曲(NeisseriarneningUidis,Nm)俗称脑膜炎球菌,是流行性脑脊髓膜炎(简称“流脑”)的主要致病菌;流脑是具有发病急、传播快、病死率高、周期性流行等特征的呼吸道传染性疾病日。荚膜多糖(Capsularpolysaccharides,CPS)是Nm的主

5、要致病因子，也是血清学分群依据。依据免疫反应和CPS抗原结构，Nm被分为13种血清群，其中具有致病性的为A、B、C、W135、X和Y群。CPS可诱导机体产生特异性抗体,具有良好的免疫原性，是Nm多糖疫苗的主要成分，在疫苗研发中得到广泛地应用。近年来，随着基因组学与分子生物学的不基金项目：国家“敢大新与创制”专项(20I3ZX094023)2.215)作者简介：于飞飞(1990-),男，硕土研究生，主要从事细馆性疫苗方面研发。通讯作者:应莲芳.研究员,E-mail:yinglfl965断发展，细菌CPS合成基因簇被破译,CPS合成相关基因越来越受到关注。重点对Nm的CPS合成及相关基因作一综述。

6、1脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖CPS是细菌表达在细胞表面的成分，Nm菌体表面的CPS厚度小于0.2呻1,是由儿种单糖通过不同的糖昔键连接唾液酸或磷酸的孤复单元构成;在侵袭宿主组织细胞时，Nm的CPS具有抵抗宿主北特异性免疫、逃避宿主特异性免疫及阻碍Nm与宿主细胞紧密黏附等作用。CPS的分子结构不同，其免疫原性和生物学功能也会存在差异。1.1 荚膜多概的分子结构除A、X群外，B、C、W135和Y群的CPS结构均为唾液酸衍生物foA群的CPS由磷酸基团连接M乙酰甘露糖胺的重复单元构成;X群CPS由磷酸基团与M乙酰葡萄糖胺连接构成。因B群CPS与胎儿神经细胞黏附分子(Neuralcelladhesionmo

7、lecule,NCAM)相似，机体对其免疫反应很弱，故CPS不能作为B群疫苗的抗原成分；据文献56报道，B群外膜蛋白囊泡(Outermembranevesicle,OMV)可作为制备结合疫苗的载体。B、C、W135、Y群的CPS结构均含有唾液酸成分。B群和C群CPS的重复单元只有唾液酸，两者的差别在于糖样键不同。在W135、Y群CPS分子中，唾液酸与一分子半乳糖或菊萄糖通过。-1,4糖廿键连接构成重复单元,W135群中连接的是半乳糖，而Y群中连接的是菊萄糖。据文献报道，NmCPS在不同位点存在不同程度的氧乙酰化，如A群C3、C4,C群C7、C8,W135,Y群C7、C9的氧乙酰化“wo】，见表

8、ioLongworth等'山从英国患者体内分离的Nm中，Y群CPS约79%被氧乙酰化，C群的氧乙酰化高达88%,而W135群仅有8%。不同程度、不同位点氧乙酰化对Nm的免疫原性产生的影响不同。C群、Y群CPS氧乙酰化会影响CPS的分子构象，可能造成抗原的活性表位被遮蔽,而氧乙酰基却能提高A群CPS的免疫原性“°。因此，在制备多糖蛋白结合疫苗时,必须对氧乙酰基含量及氧乙酰化位点进行质控。流脑结合疫苗常利用NaIO4或氧化剂对多糖进行活化，通过还原胺化或酰胺缩合等方法使蛋白、多糖结合的。表1六种脑膜炎奈瑟曲荚膜多糖化学结构Tab.1StructuresofsixtypesofN.

9、meningitidiscapsularpolysaccharides血清群化学结构氧乙酰化位点A-6)-ManNAc-a-1-(PO4-C-3,C-4B-8)-NeuAc-a(2-/C-9)-NeuAc-a(2-07,08W135-6)-Gal-a(1,4)-NeuAc-a(2-C-7.C-9X-4)-GlcNAc-a-l-(PO4-/Y-6)-Glc-a(1,4)-NeuAc-a(2-C-7.C-9注:/为无。1.2荚膜多糖的生物学功能1.2.1抵抗宿主非特异性免疫CPS抵抗宿主非特异性免疫主要表现为:抵抗阳离子抗菌肽:阳离子抗菌肽能破坏细菌胞质膜结构，引起膜两侧离子流通不受控制，带有负电

10、荷的CPS能结合阳离子抗菌肽保护细胞膜结构。Spinosa等研究显示，NmCPS合成基因(siaD和HpK)与一种参与抵抗阳离子抗菌肽的外排泵编码基因在感染期的细胞内表达上调，表明CPS保护Nm使其在宿主细胞内存活，可能与CPS抵抗宿主体液中的阳离子抗茵肽有关;抑制吞噬作用:调理素蛋白C3b能与细菌表面抗原结合促进吞噬细胞的吞噬功能，NmCPS能有效抑制C3b在细菌表面的沉积。Ram等"研究发现,B群和C群CPS所含的唾液酸结构能减少C31)蛋白与自身荚膜的结合；A群CPSC6位的羟基被磷酸化，同时细胞表面C3b的数量减少，原因可能是C3b与细胞表面共价结合时所需要的亲合试剂匮乏;C

11、PS结构中的甘油侧链对亲合的羟基产生空间位阻，也会导致细胞表面C3b的数量减少，但在W135群和Y群CPS中，会出现相反现象;抵抗补体介导的杀伤作用：NmCPS处于菌细胞的最外层，能保护萌体避免补体的损伤作用。Lewis等3研究报道,NmCPS能抵抗补体介导的杀伤作用，无CPS或者CPS变异的Nm菌株对人体血清杀伤作用高度敏感。12.2逃避宿主特异性免疫大多数细菌在宿主特异性免疫反应下会被清除，但B群CPS与人体内NCAM结构相似,不能引起机体的特异性免疫反应。NmCPS易发生荚膜互换是逃避宿主特异性免疫的另一机制O1.2.3影响细菌与宿主细胞的黏附Nm与宿主细胞的黏附分两个阶段:起初黏附阶段

12、和紧密黏附阶段0Deghmane等发现，在起初黏附阶段，CPS与菌毛能促进Nm黏附于细胞表面;但在紧密黏附阶段，由于CPS遮盖了Nm菌体表面的结合位点而阻碍细菌与细胞紧密接触;CPS是阻碍Nm与宿主细胞紧密黏附的表面结构，当Nm与宿主细胞的黏附由第-阶段转为第二阶段时，通过CrgA蛋白介导使合成CPS的基因表达下调，以促进Nm对宿主细胞的黏附和入侵。2脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的合成NmCPS的合成途径为ATP-结合盒转运体依赖途径(乂称为ABC转运体依赖途径)r，7*，8JoCPS的合成一般分为多糖合成的起始、糖重复单元的合成和多糖的输出三个部分。CPS合成的起始位点在内膜的胞质面，由糖基转移酶(

13、Glycosyltransferase,GT)催化合成多糖重复单元后通过ABC转运体依赖途径由内膜胞质面转运至细胞表面。ABC转运体系统由两个相同的核昔酸结合域(Nucleotide-bindingdomain,NBD)的多肽和两个跨膜结构域(Transmembranedomain,TMD)的多肽组成，完成多糖从内膜转运到细胞表面还需要另外的两种组分，多糖聚合酶(Polysaccharideco-polymerase-3,PCP-3)和外膜蛋白(Outermembranepolysaccharideexporter,OPX)职。这两种组分形成蛋白复合物促使CPS流出。CPS具有保守的糖脂还原末

14、端，通过多聚2-酮基.3-脱氧辛酸与CPS还原端相连接，在CPS的输出过程中起锚定多糖的作用加。2.1多糖合成的起始NmCPS合成起始位点在细胞膜的胞质而。起始阶段需要糖基核昔酸供体和一种未知的内源性受体的参与，并旦链的延伸需要渐进性GT20,o细胞质中存在大量的糖基核昔酸，GT转移糖核苜酸供体上的糖残基到受体上形成多糖延伸的起始结构糖链在不同的GT作用下开始延伸形成一个个重复单元)。2.2糖重复单元的合成糖再复单元的合成一般经历三个过程:延伸，翻转和聚合。在NmABC转运体依赖途径中,GT在多糖垂复单元的合成中起重要作用。结构变化多样的GT,催化特异糖基转移到CPS非还原端使糖链延伸,4*2

15、2,O糖重复单元的聚合发生在细胞膜的胞质面，糖链通过末端糖脂锚定在细胞膜上,经内膜移位到周质间隙时发生翻转聚合。2.2.1 A群和X群CPS的合成Fiebig等)在A群CPS的合成中，利用M乙酰葡萄糖胺异构曲催化UDP-GlcNAc生成UDP.ManNA,其在多聚甘露糖磷酸转移前作用下，转移ManNAc-lP到糖链的非还原端。其中/乙酰前萄糖胺异构酶由cps基因簇中的csaA编码，多聚甘露糖磷酸转移酶由csaB编码。Muindi等报道，合成X群CPS的GT是*乙酰菊萄糖基磷酸转移酶，在该酶的催化作用下，Glc-NAc-lP从UDP-GlcNAc转移到GlcNAc-IP寡糖的4-0H上形成多糖重

16、复单元。在合成X群CPS的过程中,乙酰葡萄糖磷酸转移酶在pH为7.07.6的HEPES缓冲液中活性最大。合成A群、X群CPS的GT与隐形蛋白家族具有显著的序列相似性B群和C群CPS的合成B群和C群CPS中的cr-2,8-M乙酰神经氨酸(a-2,8-A-acetylneuramieacid,a-2,8NeuAc)或a-2,9NeuAc结构均由单一结构域的多聚唾液酸转移W(Polysialyltransferase,PST)合成日，。起初,siaA基因产物催化6-磷酸氮乙酰葡萄糖胺生成6-磷酸氮乙酰甘露糖胺,上述产物去磷酸化，与磷酸烯醇式丙酮酸缩合生成Neu5Ac,Neu5Ac被活化后生成CMP-

17、伊Neu5Ac；在PST的催化作用下，CMP缶NeuAc结构中的NeuAc转移到延伸的唾液酸聚合链上。PST具有广泛的底物特异性，针对不同连接方式的底物，都可延伸为”2,8或m2,9糖昔键连接的唾液酸链。嵌合PST试验表明，控制产物连接的部分蛋白位于前100个氨基酸上，该区域的微弱变化会导致供体和受体结合口袋方位的改变，从而使唾液酸分子间产生各种不同的连接方式126-27102.2.2 W135群和Y群CPS的合成W135群和Y群CPS的结构相似，只是己糖C4位置的立体化学结构不同。W135群含半乳糖，Y群含葡萄糖，两者的微弱差异足以提供不同的抗原表位，从而使机体产生针对各自多糖聚合物的特异性

18、抗体】。两者的CPS均由结构上为单一多肽的酶聚合而成，多肽相似度为97%。与PST不同，合成W135和Y群CPS的酶属于GT-4家族，包含N末端己糖转移的和C末端唾液酸转移酶两个结构域。己糖转移酶与唾液酸转移能的活性归因于GT-B折叠。W135群和Y群CPS结构中，半乳糖、葡萄糖的特异性是由己糖转移酶结构域上的310位单一敏基酸决定)。含脯基酸残基的酶具有半乳糖基转移前活性，而含甘基酸的能具有葡萄糖转移瓣活性。这些残基位于EX7E基序中间,体现了GT-4酶保守的特性，并协调与UDP-糖供体的结合。2.3多糖的输出CPS的输出系统中NBI)高度保守，含有结合ATP的核心结构域。NBD可偶联ATP

19、水解，通过TMD结构的变化，使复杂分穿过膜转移到细胞表面或者使小分子物质转移进细胞3叫O细萌多糖合成系统中的NBT)有两种类型，一种发现于脂多糖。抗原和S-层多糖的生成过程中，该类型含有延伸的C-末端结构域；另一种类型的NBD缺乏结合糖链的结构，该类型的NBD可见于CPS的输出系统边。Willis等研究表明，多糖最终从胞质面转运到细胞表面的过程是由PCP-3-OPX蛋白复合物所完成。ABC转运体输出CPS的具体机制目前尚不清楚，但末端糖脂对CPS的输出很重要，它可能提供了一种输出信号SoVimr等乂发现,蛋白间相互作用可能促使CPS的合成与输出偶联,当合成与输出分离时，导致CPS合成失控;旦链

20、位度可能是通过链延长前的活性和ABC转运体来控制的。ABC转运体依赖途径具有多种细胞功能，除了多糖的运输外，还包括营养物质的摄入及药物、蛋白等的运输明。3脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖合成及相关基因Nm染色体大小为2.0X1062.2x106bp,包含2000个基因。其中与荚膜多糖合成相关的基因定位于约24kb的毒力岛上，该毒力岛被称为cps基因簇。（必基因簇包含六个部分，与合成和转运有关的主要是前三部分。由于合成CPS的基因位点存在一致性,各亚群荚膜合成相关基因易发生重组，出现水平基因转移现象。各菌群水平基因转移岛（Islandofhorizontaltransfer,IHT）之间的互换使得英膜发生转

21、换或脱落。调控NmCPS合成的主要方式是cps在转录阶段的调控和IHT的重组互换。3.1cps基因簇的结构及功能cps基因簇与NmCPS的合成及转运有关。该基因簇由六个区域组成，分别为A、B、C、D、D'、E区A区包含多糖合成的操纵子3，,syn）,其中B、C、W135、Y血清群的A区都是由siaA、siaB、si«D四部分构成，siaA、siaB、sM在所有群中都很保守，旦功能相同；X群A区含有三个开放性阅读框,cs'A、cmB、cs%C,当CPS寡糖引物存在时,cs先A能产生具有免疫学和化学特性的多糖长链聚合物B区包含如基因，负责脂质的修饰，Nm的lipA、l，p

22、B与syu.ctr操纵子基因位点是分隔开的编码的蛋白参与多糖聚合物还原端二酰基磷酸基团的取代，当妣、邸B缺失时，胞内脂化的英膜多糖会大量堆积】。C区包含5基因，负责荚膜多糖转运。D区负责脂多糖的合成。D，区是由D区基因复制修饰而来。E区包含了tex的同源基因网。cps基因簇的表达受控于I）上的多聚胞昔系统,A区syn、C区ctr操纵子的启动子在转录水平上对CPS合成具有调控作用。3.2syndr操纵子启动子在转录水平上对CPS合成的调控synA、swB、synC、synD与荚膜生成有关，ctrA、以rB、cZrC、cl）与膜转运有关，A区syn、C区ctr操纵子的启动子对CPS合成具有调控作用

23、。syn.ctr操纵子的启动子位于134bp的间隔区，当134bp处转录序列发生插入突变或缺失时,会导致arA、c"B、ctrC、c”D和synA、synB、synC、synD明显减弱或消失，并伴随着荚膜缺失：迎。除启动子外,syn上游的5,非翻译区（70bp）被发现有一个直接重复区和一个反向重复区。直接重复区的变异能上调syn.ctr的转录；反向重复区包含syn起始密码，可能作为操纵子转录的调控元件。通过等位基因交换，使染色体转录报告系统lacZ-ermC和synctr启动子融合表达后,发现生物合成操纵子转录水平比荚膜转运操纵子高出4倍，两启动子在静止期活性增加，表现出特异的调控作

24、用加圳。NmCPS基因的表达受控于基因开关机制及转录水平的调控。2.3 1HT转换与CPS合成Nm基因组的另一特点是多个IHT之间的转换，但这种情况并不多见。其中,IHT-A与CPS的合成和转运相关JHT-A1包含荚膜多糖合成与转运相关基因JHT-A2可能编码ABC转运体。IHT转换与基因序列滑动借配和IS元件移动有关皿。据文献41报道,1997年，Swartley等在美国西北太平洋地区，分离出具有相同基因型的B和C群的Nm,经PCR、DNA测序、Southernblot等手段分析，发现这些菌株的PST编码基因发生了同源互换;2009年,Beddek等对新西兰不太常见的W135分离株（ST-1

25、1）的荚膜基因的来源进行了研究，运用porA、porBg等位基因和MLST遗传分型方法，对107个Nm分离株进行分析，发现W135分离株（ST-11）荚膜基因来源于C血清群。IHT的转换也使得Nmcps基因簇缺失，并增加了NmCPS合成的复杂性和多样性。4结语CPS是细菌重要的毒力因子和鉴别标志，也是细菌性多糖疫苗的主要成分，对不同NmCPS合成及相关基因的掌握是制备流脑多糖疫苗的首要前提。各菌群CPS合成途径不完全相同，GT是CPS合成的关键因素。目前,GT已被广泛用于体外多糖合成试验,这使得体外合成细菌CPS成为可能皿）。对CPS合成途径的研究，有助于优化Nm培养条件，提高GT的催化效率，

26、实现NmCPS工业化生产。基因组学与分子生物学的不断发展，使NmCPS合成相关基因的研究受到广泛关注。随着Nm各血清群cps基因簇的破译，合成与转运多糖相关基因的结构和功能得到更清晰的阐明，有望揭示CPS合成机制，为安全、有效的流脑多糖及多糖结合疫苗的研究提供理论依据。参考文献：IHillDJ,GriffithsNJ,BorodinaE,etal.CellularandmolecularbiologyofNeisseriameningitiducolonizationandinvasivediseaseJJ.ClinicalScience,2010,118；547-564.2RouphaelN

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