动物基因组DNA的分离与核酸浓度的测定

1、动物基因组动物基因组DNA的分离与的分离与核酸浓度的测定核酸浓度的测定实验方法实验方法 n先将小鼠肝脏进行预处理：断颈法处死一只小鼠，先将小鼠肝脏进行预处理：断颈法处死一只小鼠，采集肝脏组织，用生理盐水清洗血污。采集肝脏组织，用生理盐水清洗血污。n取一只小鼠的肝脏（约取一只小鼠的肝脏（约2g），加入），加入20 mL匀浆缓冲匀浆缓冲液（液（STE buffer），用电动组织匀浆器匀浆至无明），用电动组织匀浆器匀浆至无明显组织块存在（最好冰浴操作）。显组织块存在（最好冰浴操作）。n将组织细胞的匀浆液体转移至将组织细胞的匀浆液体转移至15 mL蓝盖离心管中，蓝盖离心管中，4 4000 r/min离

2、心离心15 min，弃上清，留沉淀。，弃上清，留沉淀。n沉淀中加入沉淀中加入6 mL消化缓冲液（含蛋白酶消化缓冲液（含蛋白酶K），轻轻），轻轻反转混匀，反转混匀，5055 温育温育1 h。n加入加入RNA酶（酶（10mg/mL）至终浓度）至终浓度200 g/mL，37水浴水浴0.5 h。n每小组取每小组取1.5 ml EP管，加入上述消化细胞液管，加入上述消化细胞液600ul ，加，加入等体积酚氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管使两相均匀入等体积酚氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管使两相均匀混合形成乳浊液，混合形成乳浊液，1200 r/min，4离心离心10 min。n小心吸出小心吸出EP管中的上层液体，即为

3、含管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意的水相，注意不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。然不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。然后加入等体积氯仿异戊醇，后加入等体积氯仿异戊醇，12000 r/min，4离心离心10 min。(如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复操作如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复操作67)n小心吸出上层含小心吸出上层含DNA的水相，加入的水相，加入1/10体积体积NaAc，充分，充分混匀，然后加入混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，置倍体积的无水乙醇，充分混匀，置20冰箱约冰箱约2 h。n12000 r/min，4离心离心10 m

4、in，弃上清液，得到的白色，弃上清液，得到的白色沉淀。加入沉淀。加入1 mL 70冷乙醇洗涤，继续离心，获得沉淀，冷乙醇洗涤，继续离心，获得沉淀，室温干燥。加入室温干燥。加入50 L TE缓冲液溶解，即可得到基因组缓冲液溶解，即可得到基因组DNA。20冰箱保存。冰箱保存。n如果要对提取的如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝胶。进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝胶。方法是取方法是取1 l溶解的溶解的DNA样品，在样品，在1的琼脂糖凝胶中进的琼脂糖凝胶中进行电泳，用溴化乙锭（或行电泳，用溴化乙锭（或Goldenview）染色观察结果。）染色观察结果。n每组取每组取1 L 、2 L DNA

5、样品，加样品，加0.4 L电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液（含溴酚蓝），少量的水（含溴酚蓝），少量的水（10 ul），混匀后加样于琼脂），混匀后加样于琼脂糖凝胶孔内。糖凝胶孔内。n电泳（小胶电泳（小胶100-120V，大胶，大胶150-180V）：使）：使DNA移入琼移入琼脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移至中间即可停止电泳。脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移至中间即可停止电泳。n用短波紫外线（用短波紫外线（254 nm）进行拍照，比较样品）进行拍照，比较样品DNA与与DNA标准品（标准品（marker）的荧光强度（一般最亮的条带为）的荧光强度（一般最亮的条带为750bp，上样，上样5 ul约约100 ng），并计算出待测样品中），并计算出待测样品中DNA的浓度。的浓度。n如果如果DNA已经降解，已经降解，DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散