食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察

1、微生物学大实验食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察（标题小四黑体，正文小四宋体，段前、段后0， 行距20磅）专 业 班 级 姓 名 同 组 人 日 期 0 前言食品腐败变质是指食品受到各种内外因素（例如温度，气体等）的影响，造成其原有物理性质或化学性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在污染微生物的作用下分界变化、产生有害物质的过程。本次实验以略微腐烂的苹果、栗子、香蕉，饮料为材料，运用三区划线、倾注、点植、涂布等方法从中分离出腐败菌，观察和分析其菌种及菌落形态。1 试验材料和仪器设备11试验材料食材：土豆、苹果、栗子、香

2、蕉、饮料。试剂：营养琼脂粉、麦芽粉、琼脂粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、溴麝香草酚兰溶液、草酸结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、生理盐水、0.1%吕氏碱性美蓝染液、自来水等。12仪器设备 试验仪器：显微镜、蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、试管、酒精灯、接种针（环）、针、培养皿、盖玻片、载玻片、三角玻璃涂布棒等。2 试验方法2.1培养基的制备营养琼脂培养基称取4.5克营养琼脂粉，加入100ml水加热溶解，分装，在121下蒸汽灭菌。20min后取出导入无菌平皿中冷却凝固。土豆培养基将去皮土豆200g切成2cm左右小块加入1000ml水煮沸10min，过滤补充水份，加入20g琼脂粉，20g葡萄

3、糖，加热溶化，分装，121下蒸汽灭菌20min。麦芽汁培养基称取5g麦芽粉加入100ml和2g琼脂，在115下蒸汽灭菌20min。糖发酵培养基的制备.1葡萄糖发酵管取0.25g葡萄糖加入100ml的已配置好的糖溶液混合均匀即可.2葡萄糖发酵管取0.25g乳糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.3麦芽糖发酵管取0.25g麦芽糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.4蔗糖发酵管取0.25g蔗糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.5甘露醇发酵管取0.25g甘露醇加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可注:糖溶液: 蛋白胨2g,0,04%溴甲酚紫水溶液2.5ml,蒸馏水100m

4、l,调pH为7.4 分别吸取上述五种糖溶液5ml放在试管中,并放入一个小倒管.每种取两支试管.在培养箱中供糖发酵试验使用.22 分离方法221三区划线法使用接种环，将其烧灼，待冷却后，取菌。然后在酒精灯附近，将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/3-1/2，此为第一区。 再将接种环上多余的细菌烧灼，待冷后，在第一区划线末端，再划下一区域，面积约占1/4面积，此为第二区。 用同样方法划第三区，划满整个平皿。 222点植法 使用接种针，将其烧灼，然后在培养皿上点一下以降温，取菌。然后在酒精灯附近，将已沾菌的接种针在培养皿中点上一点。用相同的方法在培养基上

5、点第二个点，直至培养基上呈现均匀的六个点。223涂布法 使用三角玻璃涂布棒，在蒸汽灭菌锅内灭菌，待冷却后，取菌，然后将菌均匀的涂在培养皿上。23 培养231细菌在37±1恒温培养箱中培养24小时。232酵母菌在28恒温培养基中培养48小时。233霉菌在28恒温培养基中培养48小时。24 鉴定24.1形态鉴定.细菌：做革兰氏染色试验。a. 涂片 将培养的不同菌分别做涂片，干燥、固定。固定时通过火焰12次即 可， 不可过热，以载玻片不烫手为宜。b. 染色 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，

6、用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030s，立即用水冲净酒精。 复染 用番红液染12min，水洗。 镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。.酵母菌：a.在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液，按无菌操作法在营养琼脂培养基上取培养48小时的菌种少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。b.盖玻片，放置3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察菌体形态和出芽情况，同时根据是否染上颜色来区别死、活细胞。.霉菌：制片观察，霉菌的组织状态及孢子形状。在载玻片中央滴加一滴乳酸酚用针挑取菌落周边放在乳酸酚中搅拌均匀,盖上薄片至于显微镜观察.

7、 生理鉴定细菌：糖发酵试验。用接种环在酒精灯上经灭菌后分别接种在五种糖溶液的试管中,在37±1恒温培养箱中培养24小时后观察其产酸产气情况3 结果与讨论3.1细菌菌落的形态：培养结果：如下图是香蕉培养菌落(图一)和栗子培养菌落(图二) 图 一(涂布法) 图 二(点植法)结果分析: 香蕉中分离的菌落为微小较为规则的圆形，颜色为近似乳白色。在37±1恒温培养箱中培养24h后可嗅到一种特殊的臭味。说明该细菌在温暖，富含有机物质的培养基中能够正常的旺盛的生长。栗子中分离的菌落为不规则椭圆形，颜色为乳白色和少许黄色两种,一部分表面干瘪无光泽且多褶皱,为菌落变老,中心隆起较高呈突脐状，

8、直径在0.8-1.0cm之间。该菌在土豆琼脂培养基中繁殖旺盛,有嗜糖的特性,而且该菌落特征符合细菌菌落特征,因此初步判定该菌种为细菌。不同菌落革兰氏染色的结果1）栗子中菌落革兰氏染色结果在显微镜下的观察结果如下图（图三）： 图 三结果分析：在显微镜（油镜）下可清楚观察到该细菌经革兰氏染色后呈现红色，为革兰氏阴性菌，且菌体均无芽孢，成短杆状，所以为革兰氏阴性无芽孢杆菌。 2)香蕉中菌落经革兰氏染色后在显微镜下的观察结果如下图（图四）： 图 四结果分析:革兰氏染色可通过显微镜观察到该菌也呈红色，可判断该菌种为革兰氏阴性,且菌体较小无芽孢，成微小不规则杆状形, 为短杆菌属。3.2酵母菌菌落的形态 培

9、养的结果:从腐烂的苹果中经过麦芽培养基的培养分离得到的菌落形态如下图(图五)： 图 五（三区划线法）结果分析:从腐烂的苹果中分离的菌落呈乳白色,较不透明整体颜色一致，菌落质地均匀边缘整齐，该菌落成圆形，表面湿润光滑，富有光泽，直径1cm左右。该菌种在麦芽培养基中生长,主要用于鉴定酵母菌，而且菌落形态与酵母菌菌落形态相似，所以，该菌最有可能是酵母菌。显微镜观察结果 在载玻片上滴一滴生理盐水,用接种环灭菌后取该菌落在载玻片上,再滴一滴伊红美兰,盖片后在显微镜下可观察的形态如下图(图六). 图 六结果分析:通过显微镜低倍镜可直接观察到该菌体，说明该菌个体形态较大。且能被碱性美蓝染液染色成淡蓝色和蓝色.再通过油镜可明显观察到该菌具体形态,该菌落为均匀球型，综合上述特征可判断其为酵母菌3.3霉菌 菌落的形态从腐烂的苹果中分离得到的菌种经土豆培养基的培养形成的菌落如图(图七)： 图七结果分析:该菌落形态较大,质地疏松,表面干燥且不透明呈棉絮状交织,菌落与培养基间连接紧密,不易挑取,菌落的正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心