体外抗体形成细胞的检测—定量溶血分光光度计法（QHS）

1、1体外抗体形成细胞的检测体外抗体形成细胞的检测定量溶血分光光度计法定量溶血分光光度计法(QHS)(Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination) 2v用绵羊红细胞（用绵羊红细胞（SRBCSRBC）免疫）免疫小鼠，然后将免疫活性细胞小鼠，然后将免疫活性细胞（小鼠脾脏（小鼠脾脏B B淋巴细胞）、淋巴细胞）、SRBCSRBC和补体在液相介质中进和补体在液相介质中进行反应。行反应。SRBCSRBC与抗体形成细与抗体形成细胞所产生的胞所产生的IgMIgM结合形成抗结合形成抗原抗体复合物，原抗体复合物，激活补体系激活补体系统统，裂解，裂解S

2、RBCSRBC而释放出血红而释放出血红蛋白，以分光光度计定量测蛋白，以分光光度计定量测定。所测值反映了抗体形成定。所测值反映了抗体形成细胞产生抗体的功能。细胞产生抗体的功能。SRBC脾脏脾脏B B细胞细胞SRBC补体补体补体经典激活途径补体经典激活途径SRBC裂解裂解分光光度计检测分光光度计检测3实实 验验 步步 骤骤vSRBCSRBC及其制备及其制备 脱纤维防凝处理的脱纤维防凝处理的SRBCSRBC，以，以NSNS洗涤二次，洗涤二次，每次每次2000rpm 2000rpm 离心离心5min5min。弃上清，制成。弃上清，制成SRBCSRBC悬液，然后用血细胞计数板计数细胞，最后悬液，然后用血

3、细胞计数板计数细胞，最后稀释成稀释成1.51.510108 8 sRBC sRBC/ml/ml。4补体补体v新鲜豚鼠血清，用前经新鲜豚鼠血清，用前经SRBCSRBC吸收后，用吸收后，用RPMI1640RPMI1640稀释。稀释。v（方法在新鲜的豚鼠血清中加入经洗涤（方法在新鲜的豚鼠血清中加入经洗涤3 3次的次的压积压积SRBCSRBC，按血清与，按血清与SRBCSRBC体积比为体积比为5:15:1加入。加入。44吸收吸收30min30min后，后，3000rpm3000rpm离心离心15min15min，吸出，吸出的上清即为的上清即为RBCRBC吸收的豚鼠血清。临用前吸收的豚鼠血清。临用前1

4、1：1010稀释。）稀释。）5免疫小鼠脾细胞的制备免疫小鼠脾细胞的制备v1 1）免疫鼠制备：取上述稀释的）免疫鼠制备：取上述稀释的SRBCSRBC，经尾静脉或腹腔，经尾静脉或腹腔内注射免疫小鼠内注射免疫小鼠 （鼠龄（鼠龄8 81010周），每只周），每只0.2ml0.2ml。v2 2）取脾脏：）取脾脏：7272小时拉颈处死，取出脾脏用小时拉颈处死，取出脾脏用HanksHanks液清洗，去除脂肪和结缔组织。液清洗，去除脂肪和结缔组织。v3 3）收取脾细胞：）收取脾细胞：v在在200200目铜网上研磨，并用含目铜网上研磨，并用含5%5%小牛血清的冷小牛血清的冷HanksHanks液液冲洗，制备单个

5、脾细胞悬液，转移滤液至试管内。冲洗，制备单个脾细胞悬液，转移滤液至试管内。1500rpm1500rpm离心离心5min5min。v用含有用含有5%5%小牛血清的小牛血清的HanksHanks液洗涤一次，用液洗涤一次，用1.2ml 1.2ml HanksHanks液重悬细胞。液重悬细胞。6正式实验正式实验脾细胞悬液脾细胞悬液SRBC悬液悬液补体补体Hanks液液总体积总体积对照管对照管1ml1ml1ml3ml实验管实验管1ml1ml1ml3ml1. 1. 取两支试管，标记取两支试管，标记2. 2. 按下表加试剂按下表加试剂3. 3. 混匀，混匀，3737水浴水浴1 1小时。小时。4. 3000r

6、pm 4. 3000rpm 离心离心 5 min5 min，取上清，取上清5.7215.721分光光度计测分光光度计测413nm413nm处处ODOD值（值（HbHb量）量）7v注意事项：注意事项：v1.SRBC1.SRBC要新鲜，无溶血。要新鲜，无溶血。v2.2.离体脾细胞的制备过程要迅速，以防细胞离体脾细胞的制备过程要迅速，以防细胞死亡，细胞计数应准确。死亡，细胞计数应准确。v3.3.红细胞裂解是本实验的关键，应用力吹打，红细胞裂解是本实验的关键，应用力吹打，时间也要严格控制。时间也要严格控制。8RBCRBCWBCWBCWBCWBCWBCWBCWBCWBC1mm1mm1mm1mm细胞浓度细

7、胞浓度/ml/ml = 4 = 4个大方格中的细胞总数个大方格中的细胞总数/4 /4 10 104 4细胞浓度细胞浓度/ml/ml= 5= 5个中方格中的细胞总数个中方格中的细胞总数 5 5 10104 491mm1mm0.1mm=0.1mm3=0.110-3ml =10-4ml细胞浓度细胞浓度:细胞数细胞数/ml =5个中格的细胞数个中格的细胞数 5104（RBC计数法）计数法）细胞数细胞数/ml = 4个大格的细胞总数个大格的细胞总数/4 104 （WBC计数法）计数法）WWWW1mm10抗体制备原理：原理： 抗原免疫小鼠，激活免疫系统，抗原免疫小鼠，激活免疫系统，B B细胞活化并分化为浆细胞，产生针对特细胞活化并分化为浆细胞，产生针对特定抗原的特异性抗体。定抗原的特异性抗体。11方法方法v1.1.用移液管吸取脱纤维防凝处理的绵羊血适量用移液管吸取脱纤维防凝处理的绵羊血适量v2.2.加加2-32-3倍体积生理盐水，混匀，倍体积生理盐水，混匀，2000rpm2000rpm离心离心5 5分钟，小心吸尽上清。分钟，小心吸尽上清。v3.3.重复第二步操作。重复第二步操作。v4.4.用生理盐水配用生理盐水配20%20%、25%2