第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA第二节基因组文库的

1、第一节第一节PCRPCR扩增获得目的基因或扩增获得目的基因或cDNAcDNA第二节基因组文库的构建与基因分离第二节基因组文库的构建与基因分离第三节第三节cDNAcDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选第四节根据差异表达获得目的基因第四节根据差异表达获得目的基因第五节基因的化学合成第五节基因的化学合成第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得 基因克隆的本质是把某一目的基因克隆的本质是把某一目的DNADNA片段通过无片段通过无性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。体和寄主细胞来实现的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作：一般

2、而言，基因克隆包括四部分工作：1 1、目标、目标DNADNA片段的获得；片段的获得；2 2、克隆载体的构建；、克隆载体的构建；3 3、寄主细胞的转化；、寄主细胞的转化；4 4、重组体克隆的选择和鉴定。、重组体克隆的选择和鉴定。 目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。大肠杆菌作为寄主进行大肠杆菌作为寄主进行DNADNA克隆的实验方案克隆的实验方案DNADNA片段片段的获得的获得载体构建载体构建细菌转化细菌转化重组体重组体的鉴定的鉴定限制性内限制性内切酶消化切酶消化机械切割机械切割双链

3、双链c cDNADNA的合成的合成化学法化学法直接合成直接合成同聚物同聚物加尾加尾粘性末端粘性末端连接连接平末端平末端连接连接加接头造成加接头造成粘性末端粘性末端重组噬菌体重组噬菌体DNADNA转染转染重组质粒重组质粒的转化的转化体外包装体外包装进行转导进行转导表型鉴定表型鉴定核酸杂交核酸杂交免疫学分析免疫学分析酶切鉴定酶切鉴定PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合

4、反应必需的双引物。第一节第一节 PCR扩增获得目的基因或扩增获得目的基因或cDNA基于PCR的分离法（1）直接从基因组中扩增提取基因组DNA作模板根据目的基因序列设计引物PCR扩增适合扩增原核生物基因。真核生物基因组含有内含子！原核基因组部分原核基因组部分原核细胞原核细胞提取基因组提取基因组DNADNAPCRPCR扩增扩增基于PCR的分离法（2）从mRNA中扩增: RT-PCR提取基因组 total RNA反转录合成总cDNA作模板根据目的基因序列设计引物PCR扩增适合扩增真核生物基因。原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。目的基因目的基因 的引物的引物1 1反转录成目的基因反转录成

5、目的基因cDNAcDNA第一链第一链目的目的 基因基因cDNAcDNA第二链第二链PCRPCRmRNAmRNA目的基因目的基因 的引物的引物2 2基于PCR的分离法（3）同源序列克隆法依据：自然界的长期进化中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。方法：根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。RACE：根据已得到的不完整的：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引序列设计引物对物对mRNA3端和端和5端进行克隆，可获端进行克隆，可获得全的得全的cDNA克隆克隆 。（。（RACE克隆的

6、意克隆的意义）义） cDNAcDNA末端的快速扩增（末端的快速扩增（RACERACE）1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核克隆核心序列心序列，测序。，测序。 2、根据核心序列，设计新的引物进行、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的的3端端和和5端的扩增。端的扩增。3、拼接拼接成成 cDNA全序列的信息，设计新的引物全序列的信息，设计新的引物扩增扩增全长全长cDNA序列。序列。经典经典RACERACE技术流程技术流程 3 RACE：由含有由含有oligo（dT）的接头引物）

7、的接头引物引发合成引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与出上游引物，与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA，可得，可得到全长到全长cDNA的的3末端序列。末端序列。 5 RACE：先用先用oligo（dT）引发合成）引发合成cDNA第一链，然后在第一链第一链，然后在第一链cDNA的的3端加上端加上人工锚定序列，利用人工锚定序列，利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物特异性引物进行扩增，得到全长进行扩增，得到全长cDNA的的5末端序列。末端序列。经典经典RACERACE克隆原理克隆原理由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出5特异性引物与3引物扩增第一链cDNA可得到全长cDN