组定稿的学位和答辩博士

1、A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements forthe Degree of Doctor of ScienceIn vivo Optical Imaging and the Research on TargetingTherapy Based on Potential Biomarker of NasopharyngealCarcinomaPh.D.Candidate: Zheng YingMajor: Biomedical EngineeringSupervisor: Prof. Zhang Zhi

2、hongHuazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. ChinaJuly, 2012独创性本人所呈交的是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明的内容外，本不包含任何其它个人或集体已经或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全本的法律结果由本人承担。作者签名：日期：年月日使用书本作者完全了解学校有关保留、使用的规定，即：学校保留并向有关部门或机构送交的复印件和被查阅和借阅。本人华技大学可以将本的全部或部分内容编入有关

3、数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等保存和汇编本。，在年后适用本书。本属于不。（请在以上方框内打“”）作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华技大学博士要*摘鼻咽癌是具有地域特性的疾病，高发于我国，因此又称“瘤”。由于其发生部位较小且隐蔽，又与重要相邻，所以症状多变或不明显，导致漏诊误诊，常拖至晚期才被诊断出，而晚期的治疗效果差，5 年存活率极低，严重的影响到人类健康。因此迫切需要寻找新的鼻咽癌生物标志物，进而该生物标志物进行相应的靶向诊疗物相容性好及靶向性高的仿生纳米载体是实现特异性地肿瘤而避免其它正常组织不受毒害的有效之一。为了更好地对鼻咽癌进行研究，需要迫切地建立起可视化

4、鼻咽癌动物模型，能实时动态地监测鼻咽癌的发生发展和转移，进而有效地评估鼻咽癌的诊疗效果。本文旨在寻找出鼻咽癌潜在的生物标志物，建立高信噪比的可视化鼻咽癌动物模型，进而借由高密度脂蛋白仿生纳米载体对鼻咽癌进行有效的靶向诊疗。得出以下结果：（1）发现在鼻咽癌细胞和鼻咽癌患者病理组织中均高表达跨膜蛋白 B 类 1道夫受体（SR-B1），故将 SR-B1 定义为鼻咽癌潜在的生物标志物。研究发现高表达SR-B1 的鼻咽癌细胞，侧向迁移能力增强，而纵向侵袭能力受抑制。SR-B1 的表达量与癌细胞的生长速度和成瘤性无关。（2）发现仿高密度脂蛋白纳米颗粒（HPPS）能够特异性地识别 SR-B1 高表达的鼻咽肿

5、瘤，通过抑制肿瘤细胞的侧向迁移能力和克隆形成率，进而显著性地延缓鼻咽癌在活动物体内的生长速度。（3）尝试将携带 chol-si-bmi1 的 HPPS 用于鼻咽癌的靶向治疗，细胞水平实验结果表明，可以有效地抑制鼻咽癌的侧向迁移能力和克隆形成率，然而动物水平的实验未获得明显的肿瘤生长抑制效果。*基金资助：30911120489）。科学研究计划项目（2011CB910401）和自然科学基金（81172153,I华技大学博士（4）建立了一系列荧光蛋白标记的可视化鼻咽癌实验动物模型，为鼻咽癌的活体光学成像和靶向治疗提供了良好的动物模型。其中获得了荧光蛋白mLumin 标记的鼻咽癌 5-8F 细胞，具有

6、良好的皮下成瘤性和转移性。同时，还获得了一株不成瘤的荧光蛋白 Katushka S158A 标记鼻咽癌细胞株 5-8F-KattushkaS158A。研究证实，这些细胞株的成瘤性与其侧群细胞比率密切相关。（5）建立了基于疱疹1 胸苷激酶 (TK)、荧光蛋白（mLumin）和萤火虫荧光素酶（Fluc）的三融合报告的可视化鼻咽癌实验动物模型，可同时用于荧光成像、生物发光成像和 microPET 成像。由于将荧光蛋白引入到三融合报告中，明显提升了荧光成像的检测能力，从而为肿瘤的多模式成像研究提供了良好的多标记动物模型。本文发现了 SR-B1 为鼻咽癌的新型潜在生物标志物，为鼻咽癌的靶向诊疗提供了有效

7、的新型膜蛋白靶点。证明仿高密度脂蛋白纳米颗粒 HPPS 能有效的延缓鼻咽癌生长，且能有效的携带 siRNA 对鼻咽癌细胞进行胞浆进而达到治疗的效果。该研究建立的一系列可视化鼻咽癌动物模型，为动态监测鼻咽癌的发生发展和转移，有效的药效评估和直观的评判诊疗提供了便利。：人鼻咽癌，生物标志物，高密度脂蛋白仿生纳米载体，肿瘤靶向性，治疗，小干扰核糖核酸, 整体光学成像，荧光蛋白II华技大学博士Abstract*Nasopharyngeal carcinoma (NPC), a malignant tumor of the nasopharynx with astronggeographicaldist

8、ribution,hasahighincidenceinGuangdong,China,consequently named “Guangdong tumor”. Since the occurrence site is relatively smalland hidden, adjacent with many important organs, the symptom is changing or not obvious, resulting in misdiagnosis, late diagnosis with a poor effect and very low five-year

9、survival rate, which severely affect human health. Thus, it is in urgent need to discover new biomarkers of NPC for targeted diagnosis and treatment. The bionic nano-carrier with good biocompatibility and targeting is one of the effective means to killtumor specifically and avoid the other normal ti

10、ssues from drug toxicity. To achievebetter research on NPC, there is a serious need for establishing visible animal ms forNPC that enable dynamic monitoring of the formation, development and metastasis ofNPC, so as to effectively assess the effect of diagnosis and treatment for NPC.This article aims

11、 to look for potential biomarkers of NPC, establish visibleanimal ms for NPC with a high signal-to-noise ratio, and use high-density lipoproteinbionic nano-carrier for effective targeted diagnosis and treatment of NPC. The results are listed below:(1) We discovered that scavenger receptor class B me

12、mber 1 (SR-B1) had a highexpression in NPC cells and pathological tissues of NPC patients. So SR-B1 was defined to be a potential biomarker of NPC. Result indicated that NPC cells with high expressionof SR-B1 have stronger ability of lateral migration and weaker ability of vertical invasion.In addit

13、ion, the expression of SR-B1 does not affect the cell growth and NPCtumorigenicity.*This work was supported by the National Basic Research Program of China (Grant No.2011CB910401) and National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81172153, 30911120489).III华技大学博士(2) We discovered that HDL-m

14、iing peptide-phospholipid scaffold (HPPS) canspecifically target NPC tumors with high SR-B1 expression, and successfully inhibit the formation and development of NPC in vivo by inhibiting the lateral migration of the tumor and colony formation.(3) We tried to use HPPS carrying chol-si-bmi1 for the t

15、argeted therapy of NPC. At the cell level, it effectively inhibited lateral migration and colony formation rate of NPC.However, at the animal level, there was no significant inhibitory effect.(4) We established a series of visible animal ms for NPC labeled by fluorescentproteins, providing good anim

16、al ms for in vivo optical imaging and targetedtreatment of NPC. We obtained NPC cell line 5-8F labeled with super bright far-redfluorescent protein (mLumin), which has good subcutaneous tumorigenicity andmetastasis. We also obtained NPC cell line 5-8F-sh-SR-B1 labeled with far-red fluorescent protei

17、n (Katushka S158A), which has no tumorigenicity. Results proved that tumorigenicity activity of these cell lines is closely related to the rate of side populationcells.(5) We established a visible animal mreporter gene that included herpes simplexfor NPC based on the three fusiontype 1 thymidine kin

18、ase, mLumin and for fluorescent imaging, bioluminescentfirefly luciferase. This mcan be usedimaging and microPET imaging simultaneously. Because of the introduction of far-redprotein into the triple fusion reporter gene, the detecting ability of in vivo fluorescentimaging was enhanced, which provide

19、s a multi-labeled animal mmulti-mode imaging of tumors.for the research onIn this work, we discovered a potential biomarker for NPC (SR-B1), a membraneprotein that can aa good transport target for diagnosis and treatment of NPC. HPPSwas proved tay the growth of NPC effectively and enable cytosolic r

20、elease of carriedsiRNA in NPC cells for gene therapy. Moreover, a series of visible animal ms forIV华技大学博士NPC was established, making it convenient for dynamic monitoring of NPC occurrence, development and metastasis as well as effective assessment of efficacy and intuitivejudgment of treatment means

21、.Keywords:HumanNasopharyngealCarcinoma,biomarker,HDL-miingpeptide-phospholipid scaffold, tumor targeting, gene therapy, smallinterfering RNA, whole-body optical imaging, far-red fluorescent proteinV华技大学博士目录摘要IAbstractIII1 绪论1.1 鼻咽癌简介(1)1.2 鼻咽癌生物标志物的研究进展(6)1.3 仿HDL 纳米颗粒的研究进展(10)1.4 可视化肿瘤动物模型的建立(16)1.

22、5 选题背景及本文的主要研究内容(24)2SR-B1 为潜在的鼻咽癌生物标志物的确立2.1 引言(27)2.2 实验材料和方法(28)2.3 实验结果(40)2.4 讨论(46)2.5 本章小结(47)3HPPS 抑制鼻咽癌生长的作用效应评价3.1 引言(48)3.2 实验材料和方法(48)3.3 实验结果(54)VI华技大学博士3.4 讨论(60)3.5 本章小结(61)4HPPS 装载 chol-si-Bmi1 的效率及其生物学效应评价4.1 引言(62)4.2 实验材料和方法(62)4.3 实验结果(64)4.4 讨论(72)4.5 本章小结(73)5光学成像可视化鼻咽癌实验动物模型的建

23、立5.1 引言(74)5.2 实验材料和方法(77)5.3 实验结果(94)5.4 讨论(105)5.5 本章小结(106)6结论与展望6.1 本文的研究内容和结论(108)6.2 本文的创新点和展望(109)致谢(111)参考文献(113)VII华技大学博士附录攻读学位期间目录(125)VIII华技大学博士1绪论1.1鼻咽癌简介1.1.1什么是鼻咽癌鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是鼻咽部上皮细胞发生的一种疾病。咽分为鼻咽、口咽和喉咽三部分。下面主要介绍鼻咽部，如图 1-1 所示，鼻咽在鼻腔的后方，上达颅底，下至软腭游离缘水平面。鼻咽的前方跟后鼻孔和鼻中隔后

24、缘相连。顶部由蝶骨体和枕骨底了略微成拱顶状向后下的斜面。在顶壁与后壁交界处的淋巴组织称增殖体或咽扁桃体、腺样体（pharyngeal tonsil, adenoid），后壁约在相当第一、二颈椎跟口咽部后壁相连续，统称为咽后壁。鼻咽的左右两侧下鼻甲后端约 1 cm 处有一漏斗状开口为咽鼓管咽口（pharyngeal orifices of tympanopharyngeal tube），此口的前、上、后缘为由咽鼓管软骨末端形成的唇状隆起称咽鼓管隆突，又称咽鼓管圆枕（torus tubalis）。在咽鼓管隆突后上方有一深窝称咽隐窝（pharyngeal recess），是鼻咽癌好发部位，其上距颅底

25、破裂1 cm，故鼻咽常可循此进入颅内。一旦不幸患上鼻咽癌，癌细胞就有可能浸润到骨骨的神经时，就会出现脑神经受损的表现，临有很多鼻咽癌患者已经出现脑神经受损症状时才去就诊，届时已晚1。图 1-1 鼻咽解剖图1。Fig.1-1 Nasopharygeal Anatomical Charts1.1华技大学博士根据世界卫生组织（World Health Organization， WHO）鼻咽癌分为三类2-4：1)2)3)角化鳞状细胞癌（WHO type 1）；非角化鳞状细胞癌（WHO type 2）；化或者低分化癌，包括淋巴上皮癌和退行性变异（WHO type 3）。，由图 1-2 可以看出，尤癌”

26、。除此之外在沙捞越的本土鼻咽癌是一种有特异地理区域性和种族性的其以我国的最为高发，所以鼻咽癌又称为“也较高2。尤族、东、和地中海盆地的北非的图 1-2 鼻咽癌的地理分布。（a）1970 年中国鼻咽癌率（男，世界标准化率）（中国肿瘤数据2。库，中国科技部；（b）世界范围内鼻咽癌年Fig.1-2 The geographical distribution of nasopharyngeal carcinoma. (a) Nasopharyngeal carcinoma(NPC) mortality rate (male, world standardised rate)in the 1970s (

27、China Cancer Database,Ministry of Science and Technology of China). (b) The annual incidence of NPC worldwide in males 2.1.1.2鼻咽癌的成因尽管鼻咽癌的致病机理尚不清楚，但还是认为该过程是一个多步骤的进程（图1-3）。流行病学研究表明，导致鼻咽癌的病因主要因素分为2, 5：1)遗传易感性：中国广州地区鼻咽癌易体质显示出该疾病跟易感性和环境因素均有很大的关联。那些至其它非易感地区的二代，也保留着鼻咽癌高致死率的特性。在易感地区，中患有鼻咽癌的群体中更进一步的显示出种2华技大

28、学博士史6, 7。族和遗传的影响。事实上，约 10%鼻咽癌患者存在该疾病的图 1-3 鼻咽癌发病机理可能的模式2。Fig.1-3 Possible mof nasopharyngeal carcinoma pathogenesis2.2)环境因素：多年来，报导指出导致鼻咽癌的最重要因素是环境而不是 EB 病毒，主要是人长期食用咸鱼和腌制的，这些中含有不稳定的亚硝酸盐。中国南方人在童年时期食用咸鱼会增加患鼻咽癌的风险，该结论已在动物实验中证实，用咸鱼喂养的鼠在鼻腔发生是跟食用咸鱼剂量存在依赖的5, 8。大量的流行病学文献概述了在多个成人食用腌制和非腌制素菜跟鼻咽癌的关联，食用腌制蔬菜的患病风险会

29、提高两倍，而大量食用非腌制蔬菜的患病风险会降低36%9。另外，长期于空气和粉层也会增加鼻咽癌的患病风险10。3华技大学博士3)EB：EB（Epstein-Bar）为人 B 型嗜淋巴细胞疱疹，他跟多种肿瘤都有关联，但鼻咽癌异于其它头颈肿瘤，跟 EB有非常密切的联系11。1966 年血清学研究发现了鼻咽癌和 EB的，随后鼻咽癌肿瘤细胞中有 EB的 DNA 和 EB核抗原（EBVA）蛋白。即 EB在鼻咽癌病发过起着重要的作用（极有可能是地域性上不可或缺的因素）12。4)烟酒：吸烟是头颈肿瘤的最大致病因素，患有鼻咽癌的吸烟者最可能患角化85%的头颈肿瘤跟吸烟有关，烟酒一起就更加增加了患病的鳞状细胞癌。

30、文献风险。但是对于鼻咽癌其影响还是比其它的头颈癌小13。：患鼻咽癌的几率是女性的两倍13。5)1.1.3鼻咽癌治疗现状鼻咽癌在东南亚易感区有着每 100,000 人中有 20 人的年，在全球每年增加 80,000 新病例，50,000 人死于鼻咽癌4。目前临采用的治疗方式通常有放疗、靶向治疗14, 15。临化疗、手术、中治疗、免疫和不同分期的鼻咽癌治疗的也是不同的，下面简单介绍各种治疗效果。1)放疗：放射治疗是没有发生远处转移鼻咽癌的首选和主要治疗方式。其治疗效果受复发和再次治疗的影响较大。2)化疗：化疗可以抑制放疗照射以外的肿瘤病灶尤其是微小转移灶处的肿瘤细胞生长，通常会与放疗协同治疗。化疗

31、的策略包括诱导化疗、同期放化疗、辅助化疗以及这几种方法的综合运用。3)手术：鼻咽癌临床手术治疗已经应用了较长时间，疗效比较显著，其 5 年局部和区域率为 81.7-85.0%，5 年生存率达到 75%。治疗：中药治疗鼻咽癌机制包括诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞增殖、4)中诱导癌细胞分化以及调节细胞内信号转导等，诱导细胞凋亡的途径仍然是大多数重要抗鼻咽癌的共同方法。5)免疫和靶向治疗：鼻咽癌免疫及治疗大体分为非特异性免疫治疗、细胞因子治疗、过继免疫治疗、单克隆抗体治疗、肿瘤治疗和治疗几大类，4华技大学博士具体如下：(1) 非特异性免疫治疗：临床研究提示，淋巴细胞浸润能抑制病灶向邻近淋巴结转移，使得鼻

32、咽癌患者获益。所以应用非特异性免疫调节剂可能会非特异地增强机体免疫，从而提高抗肿瘤的能力。(2) 细胞因子治疗：细胞因子为目前生物治疗中应用最的一类生物调节剂，与肿瘤生物治疗相关的细胞因子主要是白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、转化生长因子（TGF）、肿瘤坏死因子（TNF）和集落刺激因子（CSF）五类。目前临床疗效较为稳定的制药有白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子。(3) 过继免疫治疗：过继免疫治疗是注射免疫活性细胞增强患者免疫功能达到抗肿瘤效果的生物治疗方法。目前研究比较多的免疫活性细胞为细胞毒 T 淋巴细胞（CTL）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和淋巴因子激活细胞（LAK）。大多进展中的鼻

33、咽癌跟 EB前的关注热点。有关。因此，EBV 特异性多克隆 CTLs 研究成为了目(4) 单克隆抗体治疗：伴随着杂交瘤技术的发展，单克隆抗体的以及在肿瘤治疗中的应用已取得了极大的进展。临显示EGFR 的单克隆抗体 C225 对鼻咽癌的治疗也逐渐展现其优势。在动物实验水平鼻咽癌较为有效的单克隆抗体有BAC5 和(5) 肿瘤Her-2 靶向性治疗的单克隆抗体 Herceptin。治疗：肿瘤治疗是肿瘤特异性的主要免疫治疗，主要含有肿瘤细胞、肿瘤多肽、肿瘤核酸、肿瘤工程、抗独特型抗体肿瘤和树突状细胞，大多还处于基础研究和临床实验阶段。(6)靶向治疗：靶向治疗是使用小化合物、多肽等物质特异性地干预肿瘤细

34、胞生物学行为的信号通路，来达到抑制肿瘤的发展。临床证明，该方法不但可以“杀灭肿瘤”，且能诱导肿瘤细胞向正常细胞分化，或者通过抑制癌缓肿瘤发展致使患者“带瘤生存”16。、延1.1.4鼻咽癌治疗的鉴于鼻咽癌的自然进化史，发展有效且有意义的治疗策略仍是一个极有意义的挑5华技大学博士战。包括基础研究要解决临床的问题，开发疾病的重要和获取遗传信号通路中的相关知识，进而形成创新性的治疗策略。通常病因学（基于免疫治疗）和纠正选定的致瘤途径来实现靶向治疗是推动该发展的一步。同时认识和探索鼻咽癌患者的预后和的生物标志物也是非常必要的，这样对于患者可以提供全新和/或辅助治疗。最后，比较重要的是，还有相当数量的患者

35、在地跟该疾病战斗，但长期生活在治疗的毒性中，所以要特别注意掌控好鼻咽癌幸存者的治疗相关副作用4。因此迫切需要寻求生物标志物来进行性的靶向治疗，进而有效地给鼻咽癌患者治疗以及降低治疗过带来的副作用。1.2鼻咽癌生物标志物的研究进展1.2.1生物标志物简介（NCI）资料显示，生物标志物就是“血液、其它体液或是按照组织中发现的生物，该是正常或不正常的标志，又或者是健康或疾病的标志”。生物标志物可以从健康人中典型地区分受到影响的患者。该变化可能是由于一系列的因素导致的，包括种系或是体细胞突变，转录改变和翻译后修饰。生物标志物的种类非常多，包含蛋白（如酶或受体）、核酸（如microRNA 或其它非编码R

36、NA）、抗体和多肽。生物标志物也可以是变更的集合，如表达、蛋白组学和代谢组学的识别标志。生物标志物可以在循环（全血、血清或血浆）或者排泄物或物中（粪便、尿唾液或溢液）检测到，并能很方便地无创和连续地检测，也可以是组织来源，要么需要活检或是特异成像来评估。遗传生物标志物可以继承，并能从全血、唾液，或口腔细胞检测到种系 DNA 的序列突变，也可以是体细胞，并确定为源自肿瘤 DNA 的突变17。生物标志物可以在多发性临床应用中对进行评估，包括疾病的风险估计，隐藏癌的筛查，区分良性恶性结果，或是的类型，确定的患者预后，监视疾病的状态以及检测复发或确定治疗的应答和进展。这些例子如表 1-1 所示，某些生

37、物标志物只能在特定的环境中使用，同时也存在多种用途的其它生物标6华技大学博士志物。可以用多种方法来鉴定潜在的生物标志物。经典的方法是基于肿瘤生物学，周围环境或者是药剂代谢来鉴定候选生物标志物。随着肿瘤新知识的爆发和新技术的出现，生物标志物的鉴定通常是使用“发现”的，利用高通量、表达阵列和质谱技术快速地从一批候选生物标志物中鉴定出个别生物标志物或生物标志物组群。用这些技术生成的大量数据意味着需要特别注意研究的设计和数据的分析，以最大限度地减少假阳性。需要详细讨论生物标志物发展的关键问题包括谨慎地进行研究设计来避免偏差，全面地测试和鉴定以及准确地报导结果17。生物标志物的潜在应用17。表 1-1T

38、able 1-1 Potential uses for cancer biomarkers17.应用实例癌）18, 19BRCA1 种系突变（进展期风险评估和癌）20筛选特异抗原（分化诊断免疫组化组织）21疾病的预后21 种复发评分（KRAS 突变和抗 EGFR 抗体（大肠癌）22治疗反应和胃癌）23HER2 表达和抗 HER2 治疗（）24雌激素受体表达（CEA（大肠癌）25检测疾病复发AFP, LDH, HCG（生殖细胞肿瘤）26）27CA15-3 and CEA（检测转移疾病的反应和进展潜在的生物标志物要应用到临床之前必须一系列的。首先，要分析大量的样品来测定特定潜能的新生物标志物，或者

39、设法发现新的生物标志物。随后涉及到分析的样本群来证实原假定设想的结果，以及附加评估来确定新的生物标志物可以提供对临床决策有用的信息。这些概念被命名为分析效度、临床效度和临7华技大学博士床效用17, 28。生物标志物融入到了几乎每个患者的诊断和治疗中，当新药的开发，它们需要在批准前通过高水平的评核以及进行精心设计和随机的临床试验检测。不幸的是，相似的要求却没有被用到生物标志物上，尽管它们可以明显地影响患者的疗效。因此，清醒的认识到合适生物标志物的发展问题，对于临床，转化医学和实验研究来说非常重要，有利于将有效的生物标志物进入临床，同时避免引入那些没用、甚至是有害的、没有充分被评定的生物标志物17

40、。1.2.2鼻咽癌生物标志物的分类及其应用目前，鼻咽癌的发病机制尚不清楚，治疗效果有待提高，其主要的是鼻咽癌发病部位隐蔽且鼻咽部组成结构复杂，临床治疗方式较为单一且治疗缺乏特异性，又因为不同的鼻咽癌患者之间在病理类型、就诊时病变程度、肿瘤的分化程度、临床表现、对放化疗的敏感性、体质等方面都存在着不同程度的差异。因此寻找鼻咽癌不同时期的生物标记物对鼻咽癌的诊断、治疗和预后都存在着深远的意义29。借由蛋白质组学技术鉴定发现的鼻咽癌生物标志物见表 1-2，通常鼻咽癌生物标志物分为如下几类：1)2)3)病原学上的生物标志物，癌发生的生物标志物，诊断生物标志物，4)5)治疗应答的生物标志物，和进展的生物

41、标志物，6)7)EB相关鼻咽癌的生物标志物，靶向治疗的生物标志物：2006 年生理学医学奖发现了 RNA 干扰（RNAi）沉默双链 RNA 技术，将疾病的治疗引导至一个新的水平。瞬时转染bcl-xL siRNA 能有效地抑制肿瘤细胞的生长并诱导其凋亡。用 RNAi 敲除 bcl-xL 表达诱导鼻咽癌细胞凋亡显示 siRNA 技术可以给抗鼻咽癌治疗提供新方法。用 RNAi沉默上皮生长因子受体能降低肿瘤细胞的增殖并将细胞周期捕获在 G1 期，阐明8华技大学博士RNAi 能用于对鼻咽癌的发病机理和治疗的进一步研究。用进行信号通路分析显示 NF-B2 和生存素上调在增加抗凋亡方面起着重要的作用，如同整

42、合蛋白和 Wnt/-连环蛋白信号的变更会导致不可控的增殖。经 RNAi 证实生存素在鼻咽癌中抗凋亡作用能作为鼻咽癌中新的治疗靶点30。表 1-2 鼻咽癌中借助蛋白质组学技术鉴定的生物标志物29。Table 1-2 Biomarkers identified by proteomics technologies in nasopharyngeal carcinoma29.技术主要用途生物标志物双向电泳和基质辅助激光诊断纤连蛋白、Mac-2 结合蛋白、纤溶酶原激解吸/电离飞行时间质谱活剂抑制物膜联蛋白 A2、热休克蛋白 27、微信号靶标蛋白、膜联蛋白、基本转录因子 3、孔蛋白治疗反应监测血浆铜蓝蛋

43、白表面增强激光/电离飞间-胰蛋白酶抑制剂前体诊断行时间质谱和串联质谱治疗反应监测血小板因子 4血清淀粉样 A预后综上所述，鼻咽癌的发生发展是多个原癌或抑癌共同参与的结果，其相互制约功能失衡是鼻咽癌发生发展的基础。截至目前为止，这些生物标志物还是处于摸索探讨阶段，还需要系统研究癌发不同阶段的生物靶点，并需大量临床样品进行验证，再通过临床试验进行有效的评估，用以寻找更有效的鼻咽癌早期诊断和实现个性化治疗的靶标。治疗的进出现过两次飞跃，第一次是 Halsted 于 1890 年提出的肿瘤根治术的概念，二是 Fish 于 20 世纪 70 年代提出将化疗与根治术整合（辅助化疗）。至此以后，的治疗就一直

44、徘徊不前，直到靶向的出现。因此寻找鼻咽癌优异的标志物是实现鼻咽癌有效早期诊断和治疗的最为重要的途径之一14-16。9华技大学博士1.3仿HDL 纳米颗粒的研究进展检测 530 例患者和 415 例非患者的高密度脂蛋白水平，发现前者的HDL 水平比后者的要低。在转移的要低31, 32，证明 HDL 跟患者中，发生转移的患者，其 HDL 水平比未发生的发生发展及其转移可能存在一定的关联。HDL仿生多肽 L4F (DWFKAFYDKVAEKFKEAF)和 G * (LVGRQLEEFL)能抑制直肠癌和癌动物模型中肿瘤的生长和发展33。又 HDL 可以作为引人注目的载体，尤其是用于化疗34。此外，另有

45、提出 HDL 能促进肿瘤细胞的增殖35, 36，肿瘤细胞通过 SR-B1/CLA-1 受体途径从 HDL 中获取胆固醇，而 SR-B1/CLA-1 的突细胞的生长37。因此可以推断介导胆固醇的 HDL 受体在肿变体能抑制瘤和肿瘤细胞中与其生长增殖能力有一定的关联。1.3.1SR-B1 结构和分布SR-B1，量约 82 kD，是由 509 个氨基酸组成的膜糖蛋白，如图 1-4 所示结构酷似马蹄，由 1 个大的胞外结构域，2 个跨膜结构域和 2 个胞浆结构域。其N 端胞浆结构域由 9 个氨基酸组成，N 端跨膜结构域含 22 个氨基酸，胞外结构域含有 408 个氨基酸（其中含有 9 个假定的 N-糖

46、基化位点和 6 个半胱氨酸），C 端跨膜结构域含有 23 个氨基酸和 C 端胞浆结构域含有 47 个氨基酸。其中胞外结构域构象和糖基化位点对受体的表达及其维持某些活性是非常重要的。通过定点突变技术研究发现，Asn-108 和 Asn-173 糖基化位点的突变可以显著地影响其表达和功能。两个糖基化位点的突变体介导胆固醇从 HDL 流入细胞的量急剧减少，说明 Asn-108和 Asn-173 对跨膜转运功能和胞内受体的结构具有重要的作用。有指出 SR-B1大量在细胞胞浆膜的小窝凹陷出，因此，该区域被认为是 HDL 与细胞进行胆固醇转运的部位，同时发现该跨膜区域有很强的性，该特性可能也为胆固醇的转运

47、提供了便利38, 39。10华技大学博士图 1-4 SR-B1 及其选择性摄取示意图。（a） SR-B1 结构示意图。（b）peng 等人描述 SR-B1 介导从 HDL 中选择性摄取胆固醇酯（CE）模型38。Fig.1-4 Structure schematic representation SR-B1 and selective uptake. (a) Schematic representation ofSR-B1 structure. (b) Mof SR-BI-mediated selective uptake of cholesteryl ester (CE) from HDLac

48、cording to Peng38.图 1-5 hSR-B1/CLA-a 的 mRNA（A）和蛋白质（B）的组织分布。A，人各组织 mRNA 的表达水平。B，各组织蛋白表达水平。除了肾上腺组织的上样量为 5 mg 的膜蛋白，其余组织的11华技大学博士膜蛋白上样量均为 50 mg40。Fig.1-5 Tissue distribution of human SR-BI/CLA-1 mRNA (A) and protein (B). A, the mRNA transcriptional lever of human organs. B, the protein expression lever

49、of human organs. All proteinsample quantity is 50 mg except that the human f40.adrenal tissue loading sample quantity is 5 mgSR-B1 广泛表达于各种组织中，Cao 等检测各组织的转录水平，发现转录水平最高的是，而胎盘、肝脏、脾脏、胸腺、结肠、白血球和小肠中的转录水平则较低，同时可以在肾上腺检测到显著的信号。用免疫印迹技术检测到在成人组织中表达 SR-B1 的有肾上腺、胎盘、肝脏、肾脏和，如图 1-5 所示，除了肾上腺组织的上样量为 5 mg 的膜蛋白，其余组织的膜蛋白

50、上样量均为 50mg。发现 mRNA 转录水平和蛋白质表达水平并不存在严格的一致性。中检测到的条带大概只有 50 kD 左右，有可能是 SR-B1 发生了降解或是可交叉反应的蛋白。另外，有趣的是肝脏 SR-B1 的量比成人的大，可能由于 SR-B1 mRNA转录拼接或是转录后修饰的差异导致的，还未可知，具体分布见图 1-540。1.3.2SR-B1 的功能及应用SR-B1 具有多配体结合特性，除了与 HDL力结合之外，还能与未修饰的LDL 和 VLDL、乙酰化 LDL（AcLDL）、氧化 LDL（OxLDL）、凋亡细胞、阴离子磷脂、血清淀粉样蛋白 A 和脂多糖等结合，对胆固醇及胆固醇酯代谢起着

51、非常重要的作用，能影响细胞质膜胆固醇的分布，从而改变膜结构，进而影响多种生理和病理功能。经研究发现，SR-B1 与 HDL 结合主要取决于 HDL 中 apoA1 的双亲性 螺旋结构，且人工的含有双亲性 螺旋结构的多肽也能于 SR-B1 结合。这给仿生纳米载体提供了很好的靶标39。SR-B1 具有如下功能41-43：1)SR-B1 调节脂质代谢：SR-B1 可以介导胆固醇的双向转运，不仅可以介导胆，还可以从外周细胞流入到 HDL。固醇从脂蛋白选择性地摄取到肝脏和类固醇目前这种机制暂时还不清楚，总共提出了三种模型，如下：12华技大学博士的脂质转运44。（1）HDL 的磷脂单层与细胞膜外小叶部分融

52、合致使 HDL（2） SR-B1 与细胞膜表面受体形成疏水通道，胆固醇可以从这个通道，由高浓度的向低浓度转运。如图 4b 所示45。（3） 细胞内吞途径46。2)SR-B1 抗动脉粥样硬化（AS）的作用：研究普遍表明 SR-B1 在动脉粥样硬化中起着保护作用。SR-B1 对 AS 的影响主要是肝脏实质细胞和产生类激素的组织选择性地摄取胆固醇，及巨噬细胞的胆固醇外泄（胆固醇逆转运），可能是导致抗 AS 的主要因素。经研究表明，SR-B1 的表达水平跟 AS 呈负相关47。3)SR-B1 介导丙型肝炎（HCV）：有研究指出，SR-B1 能跟 HCV 包装糖蛋白 E2 进行相互作用，表明 SR-B1

53、 在 HCV 进入宿主细胞时发挥作用48。除此之外，受到 SR-B1 影响的还包括 SR-B1会导致红细胞的发育和卵母细胞的发育43, 49。SR-B1 在脂溶性维生素的摄取方面起着重要的作用，如维生素 E 和类胡萝卜素47。SR-B1 表达过高会促进胆固醇的形成39。SR-B1 还参与了吞噬凋亡细胞的过程40且在癌及其某些细胞株中存在高表达40, 50。因此我们假设 SR-B1 在鼻咽癌中高表达。SR-B1 作为 HDL 受体与的关系尚不清楚，但随着研究的深入，其进行设计及其靶向性治疗的潜能将会不断地被发掘。1.3.3HPPS 结构和功能纳米技术给诊断和治疗提供新的契机。基于蛋白质工程和材料科学的新型纳米级靶向方法进展给患者带来了希望。某些治疗型纳米载体已