自体血清与胎牛血清培养口腔黏膜角质细胞及上皮组织的实验研究_图文

1、自体血清与胎牛血清培养口腔黏膜角质细胞及上皮组织的实验研究刘立强李森恺范金财李养群刘元波王永前徐家杰曹蕊周传德【摘要】目的探讨自体血清培养人口腔黏膜角质细胞的可行性,为组织工程口腔黏膜用于临床提供理论和技术依据。方法应用自行制备的含10%、20%和30%自体血清的培养液及10%胎牛血清培养液,对人口腔黏膜角质细胞进行培养。对比观察不同浓度自体血清和胎牛血清培养的口腔黏膜角质细胞及上皮组织生长情况,绘制10%自体血清组及10%胎牛血清组细胞生长曲线及计算其倍增时间。并行抗2HLA免疫荧光检测培养上皮。结果各浓度自体血清组和10%胎牛血清组细胞生长及形态无明显差别,10%自体血清组细胞倍增时间为2

2、4.02±1.80h,与10%胎牛血清组20190±0179h比较,差异无统计学意义(P>0.05。各组细胞24h克隆形成率比较,差异均无统计学意义(P>0105;随自体血清浓度升高获得黏膜上皮面积增大,厚度增加,以20%自体血清组最为明显,与10%胎牛血清组培养黏膜上皮比较,差异有统计学意义(P<0.05。各组培养上皮经抗2HLA免疫荧光检测为阳性。结论制备的自体血清能完全替代胎牛血清对口腔黏膜角质细胞进行培养,且培养的口腔黏膜上皮组织分化优于胎牛血清。【关键词】自体血清胎牛血清口腔黏膜角质细胞口腔黏膜上皮组织培养中图分类号:R318Q813.11文献标

3、识码:ACorresp ond ing au thor:L IU L iqiang,E2m a il:llqqty ahoo.co 【Abstract】ObjectiveTo investigate the po ssib ility of cu ltu ring hum an o ral keratinocyte u sing au to logou s serum in o rder to p rovide theo retical and techn ical foundati on fo r clin ical app licati on of tissue engineering o

4、 ral m uco sa ep ithelium.M ethodsT he hum an o ral keratinocytes w ere cu ltu red by the m edium con tain ing differen t concen trati on s of au to logou s serum(10%,20%,30%and fetal bovine serum(10%,respectively.T he grow th conditi on s fo r the cell and the m uco sa ep ithelium in the group s w

5、ere ob served,the cell grow th cu rves w ere draw n,and the popu lati on doub ling ti m e(PD Tw as coun ted.ResultsT he resu lts show ed that the hum an o ral keratinocyte cou ld p ro liferate w ell in the m edium con tain ing au to logou s serum o r fetal bovine serum.T he differences in the242hou

6、r clone rate and PD T w ere no t sign ifican t.Bo th the area and the th ickness of the cu ltu red o ral ep ithelium increased w ith the increase of the au to logou s serum concen trati on,and the difference betw een au to logou s serum and fetal bovine serum w as sign ifican t,especially w ith the

7、m edium con tain ing20%au to logou s serum(P<0105.T he hum an natu re of the cu ltu red ep ithelium w as demon strated by the i m m unofluo rescen t mou se an ti2HLA an tigen.ConclusionT he au to logou s serum can rep lace the fetal bovine serum to cu ltu re the o ral keratinocyte w ell,and the c

8、u ltu red o ral m uco sa ep ithelium can be better differen tiated in the au to logou s serum than in the fetal bovine serum.【Key words】A u to logou s serumFetal bovine serumO ral keratinocyteO ral ep itheliumCu ltu re Founda tion ite m s:N ati onal N atu ral Science Foundati on of Ch ina(30070779;H

9、 ealth M in istry Foundati on of Ch ina (20010409血清因含有类似于体内环境条件下的多种促细胞生长营养成分和细胞因子,成为细胞培养的常规添加成分。常用血清为动物来源血清,如鸡、猪、牛等,其中基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070779;卫生部临床学科重点资助项目(20010409作者单位:中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院(北京,1000411材料与方法1.1组织取材与试剂术中剩余口腔黏膜组织(患者同意用于实验。PB S平衡盐溶液、D isp ase 酶(Roche公司,瑞士;胰蛋白酶、鼠抗人HLA2 荧光标记抗体、胰岛素5m g

10、L、转铁蛋白5m g L、腺嘌呤2413m g L、氢化可的松014m g L、上皮细胞生长因子10g L及L2谷氨酰胺584m g L(Sigm a公司,美国;胎牛血清(H yC lone公司,美国;角质细胞培养液DM E MF12=31、两性霉素B3m g L、链霉素100m g L(Gibco公司,美国;青霉素10万U L (M erck公司,德国。1.2自体血清制备术中自周围静脉抽取非抗凝血,置50m l离心管中,常温下自然凝固1h,4冰箱内过夜。将过夜的含有血清凝块离心管置于离心机中,离心半径12c m, 3000r m in离心30m in,取上清液在相同条件下重复离心1次,吸出上

11、层血清于试管中,置56水浴40m in,0122m过滤除菌。1.3口腔黏膜角质细胞培养取口腔颊部黏膜,剪除黏膜下脂肪组织,于三抗PB S中洗3遍,去除血污及碎屑,置入2.4U m l D isp ase 酶中,4冰箱中1618h后取出黏膜上皮,加入0125%胰蛋白酶,37消化15m in后加入血清培养液终止消化,吸管反复吹打,100目钢丝网过滤,离心半径3c m,1000r m in离心5m in,吸除上清液。实验分为4组,分别加入含10%、20%及30%自体血清和10%胎牛血清培养液,吸管吹打成均匀细胞悬液,以5×104个 m l接种24孔培养板,3d换液1次。细胞长满单层35d后

12、以D isp ase 酶消化掀起黏膜片。1.4培养细胞及上皮组织观察及鉴定术后16d10%自体血清组及10%胎牛血清组每24小时行细胞计数,绘制细胞生长曲线,以计算细胞倍增时间(pop u lati on doub ling ti m e,PD T,PD T= I×L og2 L ogN N0,I为传代间隔天数,N为细胞计数,N0为接种数1。倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,计数各组24h细胞克隆形成率;组织学观察培养细胞黏膜面积,挛缩率,细胞黏膜厚度。应用鼠抗人HLA2 荧光标记抗体鉴定培养上皮组织性质3。1.5统计学方法采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析,数据以均数&#

13、177;标准差表示。组间比较行方差分析,P值<0. 05为有统计学意义。2结果2.1自体血清制备去除血凝块后的自体血清呈棕褐色,约占抽取血总量的50%,水浴灭活经0.20m过滤后的自体血清转为淡黄色,透明。2.2口腔黏膜角质细胞生长变化及生长曲线细胞接种后折光性强的小球形细胞68h开始贴壁,单个细胞逐渐伸出短小伪足,胞质均匀展开,折光性降低,细胞透亮,轮廓不明显,高倍镜下可见圆形胞核,核仁2个,细胞完全展开时大小是贴壁前的23倍。接种1d后可见细胞核分裂相,即形成48个细胞为一簇的细胞克隆,接种46d细胞生长最为活跃,细胞克隆连接成片(图1。各组细胞生长及形态无明显差别,10%自体血清组

14、细胞倍增时间为24.02±1180 h,与10%胎牛血清组20190±0179h比较,差异无统计学意义(P>0.05,其生长曲线见图2。2.3培养口腔黏膜上皮组织观察各组细胞长满单层后继续分化形成复层上皮组织,出现嵴样结构,为层次较多的细胞丘,局部可见圆形角化珠;倒置显微镜下可见胎牛血清培养黏膜上皮组织表面平整光滑,角化珠较少(图3a,自体血清组“嵴”样结构明显,角化珠较多,尤以20%自体血清组最为明显(图3b。经D isp ase 酶消化均可获得完整黏膜上皮组织(图4,随自体血清浓度升高各组获得黏膜面积增大,20%和30%浓度组与10%自体血清组比较均有统计学意义(

15、P<0.05。组织学观察自体血清组黏膜分化良好,细胞排列紧密,细胞层次较多,厚约80 100m,以20%自体血清组最厚(图5a;10%胎牛血清组细胞排列疏松,细胞层次较少,厚约5070m (图5b,与10%自体血清培养黏膜比较,差异有统计学意义(P<0.05;各组24h细胞克隆形成率比较,差异无统计学意义,结果见表1。各组培养上皮经抗2 HLA免疫荧光检测均为阳性(图6。3讨论培养基是体外细胞培养赖以生存和增殖的基础,已成功开发出细胞培养的系列培养基,并在此基础上通过添加各种成分,进一步诱导细胞分化,以形成所需要的组织工程化组织4,5。因此培养基成分决定培养细胞的生长状况。目前在基

16、础培养基方面按添加血清与否分为两大类,即血清培养基和无血清培养基。在添加附加物有限的情况下,无血清培养基尚不能完全替代血清培养基,从人工合成培养液的发展历史看,大多数人工合成培养液均需补充10%20%的血清,才能成为完全适宜的培养液。Kasp erbauer等6对比应用无血清培养基和血清培养基培养上消化道黏膜细胞,实验结果提示无血清培养口腔黏膜细胞似乎只有在基质或支架材料上才能良好复层分化形成黏膜片,而添加表1人自体血清与胎牛血清培养口腔黏膜上皮组织比较(x ±s Tab .1Co mpar ison of the oral mucosa ep itheliu m cultured

17、by autologous seru m and fetal bov i ne seru m (x ±s 组别GroupS (c m 2R (%T 2(m 24h 克隆率(×103 c m 224h cloning rate (×103 c m 210%自体血清组1.16±0.1340.20±3.1053.0±1.50336.40±1.203与10%自体血清组比较P 值<0.05,33与10%自体血清组比较P 值<01053Compared w ith 10%auto logous serum ,P <0.

18、05;33compared w ith 10%auto logous serum ,P <0.05 图1倒置相差显微镜下见接种35d 时细胞生长最为活跃,细胞多克隆生长连接成片(滤光×100图210%自体血清与10%胎牛血清促细胞生长曲线图3倒置相差显微镜下见培养人口腔黏膜上皮(滤光×40a 10%胎牛血清组b 20%自体血清组图420%自体血清组培养黏膜上皮实体解剖镜观察(×7图5培养口腔黏膜上皮组织学观察(HE ×200a 20%自体血清组b 10%胎牛血清组图6培养组织经抗-HLA 检测阳性(免疫荧光染色×200F ig .1Ora

19、l kerati nocyte i n culture ,showi ng active multicolone proliferation (F ilter ×100F ig .2The proliferation curves of the oral mucosa cell cultured by 10%autologous seru m and fetal bov i ne seru m respectively F ig .3The oral mucosa ep itheliu m was observed by i nverted phasecon trast m icro

20、scope (F ilter ×40a 10%fetal bovine serum group b 20%auto logous serum group F ig .4The oral mucosa ep itheliu m cultured by 20%autologous seru m (×7F ig .5The oral mucosa ep itheliu m cultured by autologous seru m (HE ×200a 20%auto logous serum group b 10%fetal bovine serum group F i

21、g .6The hu man nature of cultured plur istrtif ication ep itheliu m were de mon strated by i m munof luorescen t mouse an ti -HLA an tigen (I mmunoh istoche m istry sta i n i ng ×200血清的培养基,细胞无须基质和支架也能复层分化良好。M izuno 等7对比应用无血清培养基与含血清培养基培养人口腔黏膜,发现无血清培养基抑制细胞分化,不能形成复层黏膜。L eigh 等8的研究结果表明无血清培养的表皮细胞寿命要

22、明显低于有血清培养的表皮细胞。显然,血清确能提供人工合成培养液中所缺少的某些生物因子和(或某些物理因素,类似于体内微环境。常用的细胞培养用胎牛血清,应用动物血清培养的细胞及组织广泛用于基础研究领域,随着组织工程的发展,组织工程化组织向临床应用的技术日趋成熟,而这种体外培养组织的应用安全性亦成为一重要研究课题。奚廷斐等9将组织工程医疗产品的应用分为同源性使用和非同源性使用,认为前者为低度危险,后者为高度危险,因此为避免异源血清带来的免疫损害和血源性传播性疾病,我们将自体血清应用于口腔黏膜细胞培养。L auer等10在培养人口腔黏膜细胞时分别应用自体血清及胎牛血清,从形态学和角质蛋白表达观察,发现

23、二者培养的细胞无差别。A nderer等11在用球形法培养自体软骨时,对比添加胎牛血清与自体血清,发现前者培养的球体内部结构破坏,仅在球体表面有软骨细胞生长,而用自体血清培养的球体结构完整,球体内部细胞存活良好,类似于人体软骨立体结构,自体血清优于胎牛血清。该实验模拟胎牛血清制作过程制备人血清,灭活后的血清清亮,淡黄色,无絮状物,以胎牛血清为对照,观察二者对人口腔黏膜细胞增殖作用的影响,以探讨自体血清作为添加成分对培养组织工程黏膜的优越性。另外如何反应不同组织间细胞增殖活力差异及不同培养液对细胞活力影响也需要一个较为直观的评价指标,传统方法为绘制细胞生长曲线或用M T T法,结果准确但操作繁琐

24、且费时较长,因此Green等(1979应用克隆形成率来直接判断组织细胞增殖能力, Tom son等(1994于细胞培养第7天开始计数克隆,可适用于低密度接种和增殖较慢组织细胞,而组织工程用种子细胞往往为高密度接种,并且口腔黏膜细胞贴壁快,增殖速度快于皮肤及其他黏膜上皮12,13,细胞倍增约为1d;我们在实验中观察到口腔黏膜细胞原代培养后1d后即形成稳定克隆,包括单细胞贴壁分裂增殖形成的细胞集落和小的组织块贴壁分裂增殖形成的细胞团,细胞活力高时可稳定贴壁并分裂增殖形成克隆,细胞活力低时贴壁不良而不能良好形成细胞克隆。鉴于以上两种原因我们提出并选择24h克隆率为细胞增殖能力指标,以反应两种血清培养

25、液对细胞活力的影响。细胞倍增时间是细胞呈对数生长期内细胞数目增加一倍所需要的时间,一般可从细胞生长曲线测量获得,该实验细胞接种浓度为5×104个 m l,发现细胞于培养后7d即长满瓶壁,此时细胞间会出现接触抑制,影响细胞的进一步增殖;而既往培养结果证明口腔黏膜角质细胞原代接种后26d为对数增长期,此后进入生长平台期6,14,我们选取接种后16d计算细胞数目绘制细胞生长曲线。结果显示10%自体血清组24h克隆率、细胞倍增时间与胎牛血清比较均无显著差异,细胞均能良好贴壁、增殖,表明人自体血清同胎牛血清一样均能良好的促进人口腔黏膜细胞的生长;细胞生长情况及抗HLA免疫荧光可见培养上皮组织表

26、达强人类细胞抗原,表明培养组织为人来源且分化良好的上皮组织;培养组织的分化优劣对于组织工程化组织的应用至关重要,只有分化良好的组织移植后才能形成功能正常组织,而不至于去分化或形成功能不良的组织,甚至肿瘤形成,因此自体血清培养在组织工程化组织的应用研究中占有重要地位。综上所述,该实验对培养的口腔黏膜上皮组织分化程度而言,人自体血清优于胎牛血清,究其原因可能为:自体血清与培养组织来源于同一个体,体外组织培养的环境类似于体内环境,含有能够最大限度的满足细胞生长增殖所需要的各种理化因素,但详细的分子生物学机制还有待进一步研究。4参考文献1Izum i K,T akacs G,T erash i,et

27、a l.E x v ivo developm ent of a compo site hum an o ral m uco sal equivalent.J O ral M axillofac Surg,1999,57(5:5712577.2R ennekampff HO,K iessig V,H ansbrough JF.Current concep ts in the developm ent of cultured sk in rep lacem ents.Surg R es,1996,62(2:2882295.3Ho rch R E,Bannasch H,Kopp J,et a l.S

28、ingle2cell suspensi ons of cultured hum an keratinocytes in fibrin2glue reconstitute the ep iderm is.Cell T ransp lantati on,1998,7(3:3092317.(4:3142317.6Kasperbauer JL,N eel HB,3rd Sco tt R E.P ro liferati on and differentiati on characteristics of no rm al hum an squamous m uco sal cells of the upper aerodigestive tract.A nn O to l R h ino l L aryngo l, 1990,99(1:29237.7M izuno H,Em i N,A be A,et a l.Successful culture and sustainability in v ivo of gene2modified hum an o ral m uco sal ep ithelium.H um Gen T her,1999,10(5:8252830.8L eigh I M,W att FM.T he culture of hum an ep iderm al kerat