HPV基因分型测定标准操作规程

1、温州市中医院检验科 SOP 免疫检验分册HPV基因分型测定标准操作规程操作规程文件号：免疫-第4版 共6页 规程编写者：叶瑾 生效日期：2008年08月11日起批准日期：2008年08月06日文件正本保存于：主任办公室 保管人：奚经巧文件副本保存于：免疫室 保管人：叶瑾 检验科主任： (签名) 项目主管： (签名) 文件执行者签名：我已阅读该文件，并将按文件要求执行1 检验申请1.1具有资格的临床医生根据需要在His医生工作站提交电子检验申请单1.2组合项目申请：HPV基因分型检测。1.3项目所在菜单：His医生工作站上的“妇科检验”。2 标本采集和处理2.1 病人的准备2.1.1 月经正常妇

2、女，在月经来潮后1018天为最佳检查时间； 2.1.2 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物； 2.1.3 检查前48小时最好不要行性生活； 2.1.4 检查前不进行醋酸或碘液涂抹； 2.2 标本采集2.2.1 按医生指示，仰卧于检查床上；2.2.2由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。 然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口采集标本；（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）2.2.3将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈； 2.2.4慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。 2.2.5 标本

3、采集后，在电脑终端检验标本采集确认，电脑自动产生标本采集时间。2.2.6 标本采集及确认后，临床标本要及时运送至检验科。检验科接收人员Lis接收电脑终端刷取标本条形码接收标本，并记录状态。对不合格标本应予拒收。2.2.7 下列标本为不合格标本：1) 标本无标识（条形码）；2) 无法辨认条形码号；3) 标识涂改；4) 未采用装有细胞保存液专用管的；5) 采样后未及时送检并且未能置4冰箱保存的；6) 标本采集过程中混入红细胞或分泌物过多的标本；7) 标本试管破裂等；2.3 标本采集的注意事项2.3.1 避免采集分泌物过多的标本，最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物；2.3.2 尽量避免血性样本，若患

4、者宫颈口充血出血，应建议改日采样。2.4 标本保存2.4.1 接收标本后，若不能马上检测，于4保存。2.4.2 标本有效保存条件及时间：普通冰箱中(2-8)稳定2周。标本均密封保存。2.4.3标本留存时间：已完成测试的标本保持完整的识别号，置48冰箱内留存7天，已分离抽提的DNA样本可于-20保存30天。3 方法原理分离提取宫颈细胞内的HPV-DNA，首先进行PCR扩增，然后以凯普医用核酸分子快速杂交仪为平台在已固定好核酸探针的低密度基因芯片膜上进行导流杂交，可一次性检测21种HPV亚型。4试剂组成：由凯普生物化学科技公司提供4.1 DNA提取试剂：包括溶液、溶液、溶液，试剂盒在2-8保存。溶

5、液临用前在45水浴中预热，溶液、溶液即开即用。4.2 PCR试剂：包括PCR Mix、DNA Taq酶 , 试剂盒在-20保存。试剂在临用前根据比例配制。（已配制的PCR试剂不能-20保存，可于2-8保存数周）4.3 杂交试剂：包括杂交液、封阻液、酶标液、溶液A、溶液B、杂交膜、NBT/BCIP，试剂盒在2-8保存。杂交液临用前在45水浴中预热。5适用仪器ABI7000 PCR扩增仪、医用核酸分子快速杂交仪6操作步骤6.1 DNA提取操作步骤6.1.1 取500ul临床样本，14000rpm离心5分钟，去上清液。6.1.2 加入400ul溶液(事先在45水浴中预热)，混匀后沸水中煮15分钟。6

6、.1.3 稍微冷却后，加入400ul溶液，混匀，室温下放置2分钟，14000rpm离心5分钟，去上清（务必去干净，可14000rpm再次离心1-2分钟后去上清）。6.1.4 室温放置2分钟，加入60ul溶液充分混匀溶解，取1ul样品做PCR检测（在做PCR之前,最好将提取的样品离心数分钟）。6.2 PCR操作步骤6.2.1 将已解冻的PCR Premix放在振荡器上振荡10 sec，放入离心机中点动；同时从冰箱中取出Taq酶管，不要振荡，放入离心机中点动。6.2.2 然后将其再放入超净工作台内，将已融化了的PCR premix管、阴性对照（蒸馏水）管及Taq酶管插在冰块上保持其在低温条件下；6

7、.2.3 按照下表给出的不同反应数所需的PCR个组份的数量准备PCR Mastermix 成 分用 量Premix（l）Taq酶（l）1人份23.250.752人份48.831.583人份73.242.364人份97.653.155人份122.063.946人份146.484.737人份170.895.518人份195.306.30N 人份N1.0523.25N1.050.756.2.4从离心管架拿出与PCR管编号相同的DNA样本管，吸取1l加入PCR管中，轻轻吸打几下， 盖上PCR管盖，垂直将枪头小心打入盛有10%次氯酸钠的废液缸中，确保移液枪前臂没有碰到废液缸口；(将DNA样本管放回放有D

8、NA样本的离心管架上，但确保摆放位置与还没有加样的DNA样本管有区别)；依次重复直到样本膜板全部加完。6.2.5对比PCR管的排列及DNA样本管的排列，确保样本加样无误。6.2.6将PCR反应管放入PCR扩增区中的PCR扩增仪中，开始PCR反应，具体程序如下： 95C 9 min95C20 sec55C30 sec40 Cycles72C30 sec72C5 min6.2.7 PCR扩增结束后，将PCR扩增管放入4C冰箱保存（短期），如需要长期保存则放入-20oCC冰箱。6.3杂交操作步骤6.3.1 杂交前准备6.3.1.1将所有杂交检测试剂放置在室温下,使其温度平衡到室温。6.3.1.2将杂

9、交液试剂瓶放入45C水浴锅中预热。6.3.1.3如果使用之前发现溶液B有沉淀，则可在45水浴条件下溶解,然后将其温度平衡到室温条件.6.3.2 HybriMax导流杂交仪准备6.3.2.1确认杂交仪电源已与杂交仪相连接，打开HybriMax.杂交仪电源；6.3.2.2在杂交仪后面的废液出口处安装好废液缸；6.3.2.3根据控制面板指示，选定Manual Mode, 按Enter键进入温度设定界面，输入温度为45后，再按Enter键确认并进行升温；6.3.2.4用60ml左右蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板并打开水泵，排出多孔板上面的水分后关闭水泵；6.3.2.5将与实验样品数相对应孔数的塑料

10、薄膜放置在金属多孔板上；6.3.2.6用镊子将杂交膜放置在塑料薄膜对应开孔上，如有多余开孔则用parafilm封口膜或塑料片覆盖，这一步要确保杂交膜湿润且没有气泡；杂交膜放置的时候要注意用来定位的两个加号向上放置；6.3.2.7在杂交膜上面放置硅胶封圈和15孔分隔室，固定好压扣盖（注意：固定时应对准反应室尾部两个孔按下往前推到底）；6.3.2.8开泵将杂交膜上的所有液体全部排除完全,然后才关泵.6.3.3导流杂交操作6.3.3.1从水浴锅中取出预热到45的杂交液，在有杂交膜的杂交孔内加入1ml预热至45的杂交液，盖上盖板温育至少2分钟。将杂交液放回水浴锅中继续水浴；6.3.3.2将PCR产物放

11、入PCR仪中进行95变性7-8 min；6.3.3.3从冰箱中取出冰块，放入塑料盒中，加少许自来水，制成冰水。将PCR管从PCR仪中取出，插入支架上直接放入冰水中，确保PCR管底部完全浸入冰水中，冰水浴2-5 min；6.3.3.4开泵，排出步骤7.3.1.1的1ml杂交液，关泵；6.3.3.5从水浴锅中取出预热到45的杂交液，吸取0.5ml预热的杂交液，加到反应槽每个孔中。6.3.3.6按照样本编号，将冰水浴中的第一个PCR产物取出，全部吸取加入第一个反应槽孔中，用枪头轻力混匀（此步骤的移液枪头均要求每加一个样本换一次，并且不要用力吹打，以免移液枪受污染）, 依次按照以上步骤，第二个、第三个

12、，直到所有实验样本均加入到杂交孔中。若设将阴性对照，则加入第一个分隔孔，阳性对照加入最后一个分隔孔。6.3.3.7盖上盖板，45条件下杂交10min。将杂交液重新放入水浴锅中；6.3.3.8对照离心管架上的1.5ml离心管样本编号，确认样本加样无误后，将样本编号及加样位置记录在记录本上。如果这些样本中有阴性对照和阳性对照样本，则将阴性对照加入第一个分隔孔，阳性对照加入最后一个分隔孔。6.3.3.9杂交后，开泵进行导流杂交，将杂交膜上的溶液排净，关泵；6.3.3.10从水浴锅中取出预热到45的杂交液，吸取0.8ml冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；此步骤重复三次。6.3.4显色过程：6.3

13、.3.1按ESC键进入温度修改界面，设定杂交仪温度为25后按Enter键确认；6.3.3.2加入0.5ml封阻液封闭膜，开泵排净所有预封阻的封阻液，关泵 (此步不必降到25就可进行)；6.3.3.3再加入0.5ml封阻液封闭膜，盖上盖板封闭5 min(此步不必降到25就可进行)；6.3.3.4开泵，将步骤7.4.16的0.5ml封阻液完全排净，关泵；6.3.3.5在温度为25(1)时, 加入0.5ml酶标液，盖上盖板温育3.5分钟；6.3.3.6开泵，将步骤7.4.18的0.5ml酶标液彻底排净，关泵；6.3.3.7吸取0.8ml溶液A冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液彻底排净，关泵；6.3.3.8

14、按ESC键进入温度修改界面，设定杂交仪温度为36后按Enter键确认；6.3.3.9吸取0.8ml溶液A冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液彻底排净，关泵；此步骤一共重复3次。6.3.3.10当温度达到 36 ( 1.0),将配好的NBT/BCIP溶液棕色小瓶取出，摇匀，加入0.5ml NBT/BCIP溶液，盖上盖板显色， 6.3.3.11显色反应大概持续5min,注意显色不能超过10min, 2分钟后打开盖板观察，如果杂交膜无颜色反应或颜色反应较淡则继续盖上盖板显色至3.5分钟再观察，如果杂交膜颜色反应较深，则开泵泵出NBT/BCIP溶液，否则多等至5分钟；6.3.3.12开泵,泵出所有NBT/BC

15、IP溶液； 吸取1ml溶液B冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；此步骤一共重复三次； 6.3.3.13吸取1ml蒸馏水冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；6.3.3.14打开压扣盖,拿走分隔室,用镊子取出杂交膜并放在吸水纸上吸干杂交膜上的水分；根据记录本记录样本所放顺序，将样本编号用铅笔写在杂交膜左下方；6.3.3.15 1小时内进行结果判读(具体的结果判读见结果判读部分)及记录，同时将杂交膜放入塑料袋中，室温黑暗保存；7 注意事项7.1 加入溶液之前, 确保溶液中没有沉淀出现, 以免影响提取效率。7.2 提取临床样本的整个过程均应该在超净工作台内进行,且将用过的枪头打入到装有10%浓

16、度次氯酸钠的废液瓶中, 以免样品交叉污染，影响后续的PCR检测。7.3 在煮沸样品时,切记不要让沸水溅入到样品管中。7.4 每次去上清时,尽量去干净,特别是步骤3, 以免影响提取效果。可14000rpm再次离心1-2分钟后动作轻柔的去上清。7.5 在做PCR之前,最好将提取的样品离心几秒钟，取样时尽量不要将枪尖碰到管底的沉淀物。7.6.杂交操作应在专用导流杂交试验区完成.7.7.请勿徒手触摸杂交膜.剪切杂交膜时,请沿杂交膜外边界剪切。对杂交膜进行操作的时候,请带手套使用镊子,操作过程中请仔细小心,切忌划破杂交膜内打印的正方形框内区域.7.8.NBT/BCIP 溶液. 应避光操作和保存8 结果判

17、定肉眼观察判定结果，结果阳性为清晰可见的蓝紫色圆点。根据膜条上HPV分布图判读阳性点为何种HPV病毒类型。9. 结果常见问题分析弱/无信号样品中HPV DNA的含量很低。确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变性PCR产物。IC及HPV分型阳性点不显色 (如右图)可能存在PCR抑制剂，可用1：10或1：40稀释DNA模板重复PCR过程，然后再杂交分析。IC点弱/不显色，但HPV分型阳性点显色（如右图）由于IC和HPV DNA之间存在竞争，高浓度的HPV DNA可能会对IC点的扩增反应产生竞争性抑制，此现象出现时如HPV分型点显色正常，则认为分型结果正确。4Biotin点不显色请确

18、认所使用试剂是否仍在有效期内。确定实验操作是否严格按照说明书进行、试剂是否按要求保存使用。5阴性对照显现HPV分型阳性点PCR试剂可能被污染，取5 ml PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。重复进行PCR及杂交试验。6很高的背景可能由于封闭不足，使未结合的酶标残留在膜上。确保封闭液完全覆盖整个杂交膜。也可能因为没有完全将未结合的试剂清洗干净，请确保在显色过程中杂交膜充分清洗，无剩余残留液体。7杂交结果中IC点不清楚，同时阳性点也不清楚或者比较淡；可能原因： 杂交温度控制不当，出现非特异性杂交点； 样本中HPV病毒DNA的浓度本身含量就很少； DNA样本中有对PCR反应的抑制物质，影响了PCR

19、扩增的效率； 解决方法：将DNA样本稀释10倍后，重新进行PCR扩增及杂交反应。8杂交结果中IC点没有，同时阳性点淡而且不清楚；可能原因： 样本中含有抑制PCR反应的物质； 样本中HPV DNA浓度较低，同样本中含有抑制PCR反应的物质； 病人样本不符合凯普分型试验要求，样本本身为阴性结果，但因为样本中有抑制PCR反应的物质，同时操作人员对杂交温度又控制不当，出现非特异性杂交点； 解决方法：增加用于扩增DNA浓度，重新进行PCR扩增及杂交反应。9杂交结果中，在杂交膜上既无IC点，也没有HPV分型阳性点显色；可能原因：可能是因为DNA模板中存在抑制PCR反应的抑制物质，首先,通过抽提得到的DNA

20、的纯度对PCR反应会有很大影响,所以必须在做PCR模板的时候将其稀释从而降低DNA溶液中抑制剂的浓度,使得PCR反应能正常进行，在一家新的医院开始试验的时候均需要摸索本院样本自身的特点。或者所取样本，不符合凯普HPV分型检测说明书中对样本的要求，样本之前经过碘染色或者病人使用了阴道冲洗药物，均会对PCR反应产生抑制。确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变性PCR产物。解决方法：如果这些情况的时候，对样本稀释10倍重新PCR，然后杂交，结果仍然不成功的情况下，建议按照凯普说明书要求重新取样检测。10.室内质控Biotin对照点反映酶与底物反应，在检测中正常应为阳性反应。IC点为内

21、对照点，是添加在PCR反应体系内的质控模板DNA探针，若扩增反应体系存在抑制因素，则IC点不显色。试剂盒附带阴性和阳性对照，可指示反应是否存在污染及各反应步骤是否正常。并不是每次试验都设阴性和阳性对照，只有在下列情况下需要做： 当新开展试验时，或更换试验地点时，需要进行阴阳性对照试验； 当使用的检测试剂批次改变的时候需要做1次阴阳性对照；当杂交结果出现令人疑惑，比如多个样本的杂交结果一样，或者杂交结果出现过多的多重感染，以及杂交试验后出现许多无IC点及阳性杂交点的结果等情况下，需要使用同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在；11 操作性能11.1. 灵敏度：25-65拷贝。11.2. 特异性:96%，不会发生交叉杂交反应。11.3.检测率：可同时检测21种HPV亚型，并能检测多重感染。11.4. 分析范围：阴阳性。12.局限性12.1. 1 本试剂仅用于诊断分型以下21HPV亚型：13种高危型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，5种低危型6、11、42、43、44，及中国人群常见型53、66、CP8304。12.2.由于个别病例可能感染量较少（低于检测灵敏度），因此阴性结果并不能完全排除HPV感染的可能性。12.3.由于采样不规范可能导致假阴性结果。12.4.本试剂盒试验结果应与其它临床数据结合起来解释。13.参考范