低氧预适应对小鼠海马组织Fas-L表达的影响

1、低氧预适应对小鼠海马组织Fas-L表达的影响 11-01-20 14:09:00 编辑：studa20 作者：姜树原 高丽君 张胜 周立社 邵国【摘要】 目的:观察重复性低氧对小鼠海马组织内Fas-L蛋白质表达的影响。方法:小鼠低氧0 次(H0)、1 次(H1)、4 次(H4)后取海马组织,应用 Western Blot 技术,检测小鼠海马组织内Fas-L的蛋白表达变化。结果:实验发现H0、H1和H4组海马组织内Fas-L有表达，H4组与H0组之间没有差异，H1组显著升高（P0.05，与H0和H1比较）。结论:急性低氧预适应使小鼠海马组织Fas-L表达改变。 【关键词】 低氧预适应;海马;Fa

2、s-L Abstract Objective：To detect the effect of hypoxia preconditioning on Fas-L expression in acute repeated hypoxic mice hippocampus. Methods：Mice were divided into 3 groups randomly and were exposed to hypoxia for 4 runs (H4 group)，1 run (H1 group) and 0 run (control group),respectively. Western w

3、as used to examine the Fas-L level in mice hippocampus after exposure to hypoxia, with total protein extracted from mice hippocampus for Western blot. Results： Fas-L was found in H0, H1 and H4 group. Fas-L protein levels were found to be increased in H1 (P0.05, vs.H4 and H0). There is no difference

4、between H4 and H0. Conclusion： The change of Fas-L protein level is closely related to protection of the brain and the formation of preconditioning in hypoxic preconditioned mice. Key words Hypoxic preconditioning ; Hippocampus ;Fas-L 低氧/缺血是造成脑组织损伤的最常见的临床因素，严重影响人类的健康。脑虽然对低氧/缺血极为敏感，但神经细胞对低氧/缺血有一定的耐受性

5、。1990年Kitagawa等1发现脑组织存在低氧/缺血预适应现象，即脑经预先亚致死性的低氧/缺血暴露，可以增强脑对随后致死性低氧/缺血的耐受力。到目前为止其具体机制尚不十分清楚，但脑保护效果却很肯定。 吕国蔚教授上世纪60年代发现小鼠经间断急性重复密闭低氧处理后，对低氧的耐受性随低氧的次数的增加而递增2。急性重复密闭低氧引起脑内众多物质发生变化，其中具有脑保护作用的一些物质发生上调，而具有脑损伤作用的物质发生下调3。Fas-L是调节细胞凋亡的重要分子，有“死亡分子”之称，但其在急性重复低氧预适应中的作用尚无报道。本工作研究Fas-L表达在急性重复低氧小鼠海马中的变化，探讨急性重复低氧预适应形

6、成脑保护过程中神经细胞凋亡的情况。1 材料与方法1.1 动物模型复制Bal b/c近交系雄性小鼠，68周龄，体重1822g，属清洁级动物，由军事医学科学院提供。按以前报道复制模型3, 即将小鼠置于含有新鲜空气、经过标定的150mL 广口瓶内,以橡皮塞密闭,记时。动物一旦出现喘呼吸（低氧耐受极限标志）,立即取出,转移到另一相同体积、含有新鲜空气的广口瓶内,密闭,记录低氧耐受时间,依此类推共进行4次低氧实验。实验分H0、H1、H4三组，H0为正常对照组，H1为低氧1次组，H4为重复低氧4次组。随后立即断头取脑，剥离海马。1.2 Western Blot将海马置冻存管液氮冻存,然后移入裂解液中，用超

7、声粉碎仪匀浆，用BCA法进行总蛋白定量，加入5上样缓冲液，配制样品，100加热10min变性。从上述各组样品中分别取75g的总蛋白上样，用8%SDS-PAGE、4、20mA电泳，当指示剂溴酚蓝电泳到分离胶时调节电流为30mA继续电泳3.5h；随后立即于4、400mA条件下通过湿转法将蛋白从SDS-PAGE胶上转移到硝酸纤维素（NC）膜上，转膜5h；将NC膜用TBS(10mmol/L Tris-Cl, pH7.5, 250mmol/L NaCl )振摇漂洗10min，10%脱脂牛奶封闭1h，再用TTBS(10mmol/L Tris-Cl, pH7.5, 250mmol/L NaCl, 0.25%

8、 Tween-20)振摇洗膜3次，每次10min；NC膜与用TTBS稀释的Fas-L多克隆抗体（1500）或actin单克隆抗体（1400）常温下孵育4h，用TTBS洗膜，方法同上，再与用TTBS稀释的二抗孵育1h, TTBS洗膜，方法同上；ECL试剂11混合与膜反应均匀，约5min。在暗室中与X光片曝光520min，再将胶片置于显影液和定影液各2min后观察。1.3 统计学处理结果以xs 表示, 用SPSS10.0 数据统计软件ANOVA 和Tukey 对组间数据进行处理和分析,以P0.05 为检验水准。2 结果2.1 不同低氧次数对小鼠耐受时间的影响见图1，由图可见随低氧次数的增加小鼠的低

9、氧耐受性增强。2.2 Western blot结果表明，Fas-L在 H0、H1和H4组中均有表达，以-actin为内参，计算各组蛋白质的相对丰度值。H0、H1和H4组Fas-L的相对丰度分别为0.860.10、1.130.21、0.910.16（n=5）。Fas-L蛋白在低氧后增加，低氧预适应后又向基础水平回落，见图2、图3。3 讨论 低氧/缺血可以影响神经细胞的正常生理功能，严重时会造成神经细胞的死亡。低氧/缺血条件下在非神经细胞中表达的死亡诱导配体（death-inducing ligands，DILs）都涉及到细胞凋亡过程，DILs包括Fas-L (APO-1L/ CD95-L)、肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL/APO-2L)以及肿瘤坏死因子-（TNF-）等4。Martin-Vill