原始不加密温州医学院临床免疫学检验

1、第十八章第十八章 免疫自动化仪器分析及应用免疫自动化仪器分析及应用温州医科大学检验医学院 张文辉 免疫检验自动化免疫检验自动化 （automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进行。进行。自动化分析技术自动化分析技术自动化免疫比浊分析技术自动化免疫比浊分析技术荧光免疫自动分析技术荧光免疫自动分析技术化学发光自动免

2、疫分析化学发光自动免疫分析酶联免疫分析技术酶联免疫分析技术第一节第一节 自动化免疫浊度分析系统自动化免疫浊度分析系统一、免疫透射比浊法一、免疫透射比浊法1959年年Schultze1967年年Ritchie1977年年sternberg 1. 1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。将待检标本和抗原参考品作适当稀释。（二）仪器工作过程（二）仪器工作过程 2. 2.将待测标本和标准抗原溶液（将待测标本和标准抗原溶液（5 5个浓度抗原标准个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在原抗体反应完成后，在340nm340nm处

3、测定各管吸光度。处测定各管吸光度。 3. 3.按按log-log-logitlogit转换或转换或y=ax3+bx2+cx+dy=ax3+bx2+cx+d方程进行曲方程进行曲线拟合，制备剂量线拟合，制备剂量- -反应曲线，由计算机处理，计反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。算出抗原浓度。（三）方法评价（三）方法评价 优点优点: : 灵敏度较单扩高，重复性好，操作简便，结果准确灵敏度较单扩高，重复性好，操作简便，结果准确 不足不足: : 抗体用量较大；抗体用量较大； 溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检透射比浊

4、测定在抗原抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。 用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 0.2 mm），），在在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚粒凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a a为单个胶为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，乳颗粒不阻碍光线透过，b b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使为抗原抗体结合形成的凝

5、聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。透射光减弱或散射光增强。 二、免疫胶乳比浊法二、免疫胶乳比浊法（一）（一）原理：原理：（二）方法评价（二）方法评价 本法敏感度大大高于普通比浊法，可达本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/Lng/L水平，操作简水平，操作简便，易自动化；便，易自动化； 血清中的血清中的RFRF可与可与IgG FcIgG Fc段结合，使段结合，使IgGIgG致敏胶乳颗粒出现致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用非特异性凝集，用F(ab)2F(ab)2片段代替片段代替IgGIgG既可消除此干扰，既可消除此干扰，又可克服又可克服IgGIgG致敏胶乳的自凝现象；致敏胶乳的自凝现象； 免

6、疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。三、免疫散射比浊法三、免疫散射比浊法( (一一) ) 原理原理II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24 I I ：与入射光成与入射光成 角处散射光强度；角处散射光强度； ：入射光的波长；入射光的波长； I I0 0：入射光的强度；入射光的强度；dn/dcdn/dc：校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；：校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；MM：颗粒分子量；：颗粒分子量； c c：浓度；：浓度；N N：阿佛加德指数；：阿佛加德指数； ：颗粒到检测器的距离；：颗粒到检测器的

7、距离； ：散射光与入射光的夹角（散射夹角）。：散射光与入射光的夹角（散射夹角）。45Debye散射散射定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应即散射光信号在开始反应7.57.5s s2min2min

8、内的第一次读数，专门在内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。 ( (二二) )定时散射比浊法（定时散射比浊法（fixed time nephelometryfixed time nephelometry）定时散射比浊法测定原理示意图定时散射比浊法测定原理示意图 5ul5ul样本样本7.57.5秒秒(1) (1) 抗体适当过量抗体适当过量 (2) (2) 对抗原过量进行阈值限定对抗原过量进行阈值限定 45ul45ul样本样本(1) (1) 抗原抗体预反应阶段抗原抗体预反应阶段 (2) (2) 反应阶段反应阶段

9、(3) (3) 信号检测信号检测 2 2分钟分钟6 6分钟（分钟（2+42+4分钟）分钟）预反应阶段预反应阶段反反 应应 阶阶 段段BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪全自动特定蛋白分析仪速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的

10、速率散射比浊法，每项检测仅散射比浊法，每项检测仅1 12min2min即可完成。即可完成。 ( (三三) )速率散射比浊法（速率散射比浊法（rate nephelometryrate nephelometry）抗原浓度递增散射光峰值峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图ABCDFGHI仪器测定技术要点仪器测定技术要点 n开启机器，进行定标开启机器，进行定标 n反应阶段反应阶段 n抗原过量检测抗原过量检测 反应时间（秒）06085散射率抗体过量抗原过量第二峰值信号抗原过量检测抗原过量检测第一次峰值信号加标准抗原( (三三) )方法评价方法评价 散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本散射比浊法是目

11、前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵准确性。但仪器和试剂价格比较贵, , 对抗体的质对抗体的质量要求很高。量要求很高。1.抗原抗体比例抗原抗体比例 2.抗体的质量抗体的质量 3.增浊剂的使用增浊剂的使用 （一）免疫比浊分析的影响因素免疫比浊分析的影响因素 四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用 4.伪浊度伪浊度 5.入射光光源和波长入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位

12、结果报告中的计量单位 7.标准曲线制备与质量控制标准曲线制备与质量控制临床应用临床应用 免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、链、免疫球蛋白亚类；补体链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前；血浆蛋白如前白蛋白白蛋白(PAB)、白蛋白、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白结合珠蛋白(HP)、，、，C-反应蛋白反应蛋白(CRP)、载脂蛋白、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白、脂蛋白(a)、类风湿因子

13、、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。某些治疗性药物浓度等。 第二节自动化学发光免疫分析系统第二节自动化学发光免疫分析系统自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘( (盒盒) )、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。 一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪 n抗原抗体结合抗原抗体结合 n洗涤、分离洗涤、分离 n加入氧化剂发光加入氧化剂发光 n 信号检测信号检测 ACS

14、ACS：180 SE180 SE和和ACSCENTAURACSCENTAUR化学发光免疫分析仪化学发光免疫分析仪ACS：180 SEACS CENTAURci8200i2000sr 酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光发光剂剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行被测，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行被测物的定量。物的定量。 常用的标记酶有常用的标记酶有辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）和和碱性

15、磷酸酶碱性磷酸酶(ALP)，常用的发光底物有常用的发光底物有鲁米诺、鲁米诺、AMPPD和和4-MUP等。等。 二、酶联发光免疫分析仪二、酶联发光免疫分析仪 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪Vitros ECi全自动增强化学发光酶免分析仪全自动增强化学发光酶免分析仪强生公司 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪Access全自动酶标记化学发光免疫分析仪全自动酶标记化学发光免疫分析仪UniCelUniCelDxI 800DxI 800IMMULITE 2000型全自动酶标记化学发光免疫分析系统型全自动酶标记化学发光免疫分析

16、系统（三）碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪（三）碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪 AXSYM全自动酶标记荧光免疫分析仪全自动酶标记荧光免疫分析仪日本东曹的日本东曹的AIA-1800型型全自动酶标记荧光免疫分析仪全自动酶标记荧光免疫分析仪 三、三、 电化学发光免疫分析仪电化学发光免疫分析仪电化学发光免疫测定工作示意图电化学发光免疫测定工作示意图 可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛贫血类等方面的检测，

17、是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。的新技术。 四、在临床免疫检测中的应用四、在临床免疫检测中的应用第三节第三节 自动化荧光免疫分析系统自动化荧光免疫分析系统 荧光免疫自动化分析主要是将抗原荧光免疫自动化分析主要是将抗原抗体结合反应与抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析技术。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，疫分析技术。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏

18、振分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。免疫测定法。 一、时间分辨荧光免疫分析仪一、时间分辨荧光免疫分析仪（二）仪器测定技术要点（二）仪器测定技术要点 抗原抗体结合抗原抗体结合 加入加入Eu3+螯合抗体螯合抗体 加入酸性增强液加入酸性增强液 4. 信号检测信号检测 auto DELFIAauto DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统全自动时间分辨荧光免疫检测系统.美国EG&GWallac公司1. TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用

19、试剂和器材应尽量防尘。试剂和器材应尽量防尘。 2.TRFIA分析用载体最常用的是聚苯乙烯微分析用载体最常用的是聚苯乙烯微96孔孔板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动装置，板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动装置，但不同厂家生产的微孔板，所产生的荧光有很大但不同厂家生产的微孔板，所产生的荧光有很大差异，应选择应用。差异，应选择应用。 （四）注意事项（四）注意事项 二、荧光偏振免疫分析仪二、荧光偏振免疫分析仪偏振光和偏振荧光发生示意图偏振光和偏振荧光发生示意图荧光偏振免疫测定工作原理示意图荧光偏振免疫测定工作原理示意图1. 1. 抗原抗体反应抗原抗体反应 2. 2.偏振荧光强度测定偏振荧光强度

20、测定 （二）（二） 仪器测定技术要点仪器测定技术要点1.FPIA1.FPIA的结果好坏取决于荧光素标记的好坏、激的结果好坏取决于荧光素标记的好坏、激发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合物的特性等因素。物的特性等因素。2. 2.为提高为提高FPIAFPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行预处理，除去干扰成分。预处理，除去干扰成分。 （三）注意事项（三）注意事项第四节第四节 自动化酶联免疫分析系统自动化酶联免疫分析系统 根据全自动酶联免疫分析系统的处理模式，人们通常将全自动酶免分根据全自动酶联免疫分析系统的处理模式，人们通

21、常将全自动酶免分析仪分成二类，一类为分体机，一类为连体机。分体机是由析仪分成二类，一类为分体机，一类为连体机。分体机是由“前处理系前处理系统统”即全自动样本处理工作站和即全自动样本处理工作站和“后处理系统后处理系统”即全自动酶免分析仪两即全自动酶免分析仪两个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动进行。育、洗涤、读数和结果打印全自动进行。n条形码识别系统条形码识

22、别系统 n样本架和加样系统样本架和加样系统 n试剂架试剂架 n温育系统温育系统 n 液路系统液路系统 n 洗板系统洗板系统 n 酶标板读数仪酶标板读数仪 n 自动装载传递系统自动装载传递系统 n 计算机管理和信息系统计算机管理和信息系统 （一）仪器组成和性能（一）仪器组成和性能回溯到回溯到 90 90 年代初期。年代初期。 全自动酶免分析系统基本特征是单全自动酶免分析系统基本特征是单/ /双针加样系统与酶双针加样系统与酶 标板处理系统一体标板处理系统一体化，多数孵育位置少于化，多数孵育位置少于 4 4 块板。块板。 加标本将占用较长时间（单针每板需加标本将占用较长时间（单针每板需 15 15

23、分钟，三块板通常需分钟，三块板通常需45 45 分钟完成加分钟完成加标本工作标本工作）。全自动酶免分析系统的发展全自动酶免分析系统的发展n目前，市场上出现的酶免目前，市场上出现的酶免工作站工作站主要有主要有：n酶免样本处理系统酶免样本处理系统n酶免后处理系统酶免后处理系统n全自动酶免一体机全自动酶免一体机n酶免连体机。酶免连体机。全自动酶免分析系统的发展全自动酶免分析系统的发展（二）仪器评价（二）仪器评价优点缺点前处理实现加样自动化，加样没有瓶颈不能进行后续的酶免实验部分后处理工作台面大小没有瓶颈，可以单独对洗板、孵育位置进行扩充缺少了核心的加样系统，需要配备前处理实现自动化一体机自动化程度高，酶免实验全过程自动化工作台面不能无限制变大，造成处理工作的瓶颈