生物蛋白纯化

1、生物蛋白纯化生物蛋白纯化1引言亲和层析的原理是：生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和层析剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时侯。待分离的生物分子就与配体发生特异性结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合

2、，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。亲和层析的优点是它分离蛋白经常只需要经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂生物蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定的蛋白纯化十分有利。3 / 142材料2.1材料和试剂2.1.1菌株与质粒大肠杆菌BL21(DE3),Genscript保藏；表达载体pColdTF,Genscript保藏；pColdTF-Cementprotein,

3、Genscript构建。2.1.2主要试剂NiTDA亲和层析凝胶：Genscript生产；LB液体培养基(g/L)：胰蛋白陈(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeastextract)5g/L,氯化钠(NaCl)5g/L,用NaOH调节该培养基的pH为7.4；氨卡青霉素溶液：50Pg/mL；IPTG：0.5mmol/L：Tris-HCl：50mM,PH8.0；蛋白Marker:TIANGEN公司，MP102；LysisBuffer:50mMTris-HC1200mM：NaCl；PH8.0：WashBufferl:50mMTris-HC1200mM：NaCl；20mM咪嘎；PH8.0；

4、WashBuffer2:50mMTris-HC1200mM：NaCl；50mM咪啜；PH8.0；ElutionBuffer:50mMTris-HC1200mM：NaCl：250mM咪嗖；PH8.0：洗涤缓冲液：150mMpBS,0.5mLTween-20(0.13%),PH7.4；封闭液:脱脂奶粉(5%),PBS；蛋白电泳试剂：丙烯酰胺、甲义双丙烯酰胺、蛋白质分子量标准为上海生工公司产品;丙烯酰胺储备液：30%(w/v)丙烯酰胺，0.8%(w/v)甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺29.2g,中又双丙烯酰胺0.8g,加蒸僚水至100mL,用滤纸过滤后于棕色瓶中4c存放；分离胶缓冲液（1.5M/L,pH8

5、.8）：18.15gTris（分析纯），用1M/LHC1调节pH至8.8,加水至100mL,4存放；浓缩胶缓冲液（0.5M/L,pH6.8）：6gTris,用1M/LHC1调节pH至6.8,加水至100mL,4存放；Tris-甘氨酸电泳缓冲液:6gTris,28.8g甘氨酸,2gSDS,加水至2L；SDS溶液（10%）：lOgSDS,加水定容至100mL,完全溶解后室温存放：过硫酸镀溶液Q0%）：0.1g过硫酸铁（分析纯），加1mL蒸你水溶解；5X样品缓冲液：0.6mLTris-HCl缓冲液（Imol/L,pH6.8）、51nL50%（v/v）甘油、2mLi0%SDS、0.5mLB一藻基乙醇、

6、ImLl%（w/v）'i臭酚蓝、0.9mL蒸水。4存放；12与分离胶的配制：蒸储水3.5mL,30%丙烯酰胺储备液（A液）4mL,分离胶缓冲液（B液）2.5mL,10%生物蛋白纯化过硫酸镀50同，TEMED5同；5%浓缩胶的配制:蒸憎水2.3mL,30%丙烯酰胺储备液（A液）0.67mL,浓缩胶缓冲液（C液）1.0mL,10%过硫酸筱30色,TEMED5M；考马斯克蓝染色液：考马斯克蓝R-2501g,甲醇450mL,冰醋酸100mL,蒸储水450mL：脱色液：甲醇200mL,冰醋酸200mL,蒸储水1600mL。封闭液：5%脱脂牛奶或者20%BSA2. 1.3主要仪器PK-8D型电热恒

7、温水槽（上海精宏实验设备有限公司）TH2-25大容量恒温震荡器（上海欣蕊自动化设备有限公司）JY98-3D超声细胞破碎仪（宇波新芝生物科技有限公司）GL21K高速离心机（湖南湘仪仪器有限公司）HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）IHZD-3紫外检测仪（上海沪西分析仪器厂）TH-300梯度混合器（上海沪西分析仪器厂）5414D型台式高速离心机（美国Eppendrof公司产品）垂直板状电泳系统（Bio-Rad公司产品）移液枪（DAIGGER）水浴锅DK-8D（上海一恒仪器）3 / 14生物蛋白纯化3方法与步骤3. 1Cementprotein重组质粒的转化不1）取重组质粒；pColdTF-Ceme

8、ntprotein仲1于100R1感受态细胞BL21中，冰浴30min；2）42水浴热激90s；3）立即放置冰上冰浴3min：4）加入600M37预热的LB液体培养基，摇床震荡培养30min：5）12000rpm离心2min,弃400M培养基，剩约200间，混匀菌体,涂布平板（A）37c过夜培养；3.2Cementprotein优化与表达鉴定41）取5支4mlLB试管培养基分别标记对照、1、2、3。2）其中对照中加入50ul葡萄糖，对照、1、2、3,分别加入4ulA,从平板中挑取5个白色菌落。分别加入5支试管。3）对照、1、2、37c摇床培养，待0D=0.6时，加4ulIPTG,37,诱导培养

9、4h；4） 4号试管37c摇床培养，待0D=0.6时,加2uHPTG,15,过夜诱导12h；5）取4只EP管分别标记对照、1、2、3。6）从试管中取200ul菌体，依次加入EP管中。7） llOOOrpm,4min,4c离心4min,去上清。8）沉淀用15NlTris重悬；再加入15同2XLoadingBuffer,沸水煮15nlin,离心，SDS-PAGED51电泳检测。3.3Cementprotein可溶性分析1）取4支1.5mlEP管标记1-沉淀、1-上清、3-沉淀、3-上清、取表达鉴定的1号管和3号管菌液分别加入1-沉淀、3-沉淀，5000rpm,3min,离心去上清，沉淀用200ul

10、Tris重悬。2）超声破碎冰水浴引（间歇时间：3s;工作时间：3s；全程时间：10min；）o3） 5000rpm,3min,离心，上清液分别倒入上清、3-上清中，1-沉淀、3-沉淀中沉淀用200ulTris重悬，4支EP管各加入200ul2XLoadingBuffer混匀沸水浴15分钟。4） 4支EP管各取8ul进行SDS-PAGE检测。3.4Cementprotein扩大培养1）接种，1%的接种量，接种到41nL液体LB培养基中，30,200rpm，摇床培养过夜，即种子液；2）转接，4mL的种子液转接到1LLB摇瓶，并向其中加入800M的A*,37,180rpm摇床震荡培养4h：3）诱导，

11、1L培养基加入400同的IPTG,于15摇床内，180rpm,过夜诱导12h；4）收菌，7000rpm,7min,4离心收集菌体，收集的菌体放于-20备用。3. 5蛋白RAC-22的纯化3.5. 1.超声破碎：1）1L培养液菌体用30血±丫515811££01'重悬，将菌液置于冰水中，超声破碎（间歇时间：3s;工作时间:3s；全程时间：15min；）；3.5.2. 菌体分离：卬1）破碎液11000RPM离心15分钟。取上清。C.Ni柱纯化蛋白1）装柱：将层析柱洗净，用去离子水润洗柱子及管道，用适量的Ni-IDA介质（5ml）装入层析柱中；2）平衡：静置完成

12、后，用LysisBuffer平衡介质至紫外检测仪示数稳定；3）上样：上清液以Iml/min的速度上样；4）洗杂：上样完成后，先用LysisBuffer洗涤；而后用WashBufferl洗涤杂蛋白至紫外检测仪数值趋于稳定。并收集样品。标记“20”。再用WashBuffer2洗涤至紫外检测仪数值趋于稳定。并收集样品，标记“50”。5）洗脱：用£山近。疝成£6洗脱目标蛋白，当紫外检测仪的示数开始变化后，取20ul加入350ul的G250中观察颜色变化。当有G250由棕色变为蓝色时，开始收集流出液于无菌的塑料瓶中,洗脱直至样品不再使G250变蓝并紫外检测仪示数不再下降。3. 5.3

13、透析卬:1）取2000ml透析液，将洗脱所得的溶液装入透析袋中，4,过夜透析12h,4. 5.4.蛋白复性：将蛋白稀释至100ul/ml的速度加入20倍体积的0.1M磷酸盐缓冲液.菌液于7000RPM,离心20分钟.取上清。5. 5.5.蛋白浓度和纯度的检测1）蛋白浓度测定,取3mlG250,加入比色皿中。A调100%,T调零。取透析所得的蛋白溶液，50ul加入3MLG250中混匀，待分光光度计数值不再变化，记录数值。6. 电泳检测蛋白纯度，将蛋白电泳图片经专业软件测定蛋白纯度。取样，取10N1电泳。3.6.蛋白印记检测（Westernblot）1013. 6.1电泳1）取样,取1011,SD

14、S-PAGE电泳。4. 6.2转膜1）准备4-6张滤纸和1张PVDF膜或C膜。戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。转膜前，NC膜要置于去离子水中浸泡Imin；PVDF膜应在中隧溶液中浸泡20min。2）在转移液里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒或滴管、滤纸和浸过的膜。3）取出SDS-PAGE胶将浓缩胶轻轻刮去。将胶在转膜缓冲液中浸泡5分钟左右，以平衡离子强度。4）打开平放底部黑色电极（阴极），放一张海绵垫片，擀气泡。于海绵垫片上放置2-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，擀气泡。取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上，排除所有气泡。将PVDF膜或NC膜置于聚丙烯酰胺凝胶上，排除

15、所有气泡。在膜上盖上2-3张转移缓冲液浸泡过的滤纸，排除所有气泡。最后盖上另一个海绵垫，放上另一张或儿张海绵垫片，盖上阳极板（白色），夹紧。保证对凝胶有一定的压力。5）将夹子放入转移槽中。转膜在冰上进行，用磁力搅拌器搅拌。用恒压60V或恒流200mA转移2h-2h30min。3. 6.3转膜免疫反应1）取膜，将膜正面超上在PBST溶液中摇动五分钟，移至含有封闭液的平皿中，室温脱色摇床上4度静置过夜。2）取出膜在PBST溶液中洗5分钟，放入含有一抗的PBST缓冲液中，室温下孵育L5h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min：3）膜放入含有二抗的PBST溶液中，室温下孵育L5h后，用P

16、BST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min：再用PBS洗二次，每次5min,进行化学发光反应。4. 6.4化学发光，显影，定影1）将A和B两种试剂（Genscript公司HRP标记的底物）在离心管中上等体积混合，避光保存；用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的液体，正面朝上置与平整的保鲜膜上，加上以上的A、B混合液2ml,使膜正面与液体充分接触，避光静置3分钟；3min后，用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的液体，置与另一平整的保鲜膜上，包好，放入X-光片夹中。2）在暗室中，将IX显影液和定影液各500nli分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片;用切纸刀剪裁适当大小；把X光片放在膜上，关上

17、X-光片夹，曝光3分钟，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。立刻将X-光片浸入定影液中，定影lOmin,用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。12 / 144.结果与分析4. 1.Cementprotein的表达鉴定11挑取菌落至4mL培养基培养，标记对照、1、2、3,摇床培养当ODw产0.6时加入4U1IPTG,而后对照、1、2、37c诱导4小时，3号试管15c过夜诱导12h,离心收集菌体，取样进行SDS-PAGE电泳分析。Cementprotein表达鉴定检测图1.1如图所示，根据专业用 无目的蛋白的表达，1 诱导58kd处也有明显望对照1

18、23 MlOOkd 75kd5Okd32kd25kd15kd3kdo对照组没有58kd处 条带。3号为15、过夜图1.lCementprotein64P-BAl蛋白表达鉴定Lanel：对照lane2：1.号Lane3：2号lane4：3号Lane5：M4. 2.Cementprotein的可溶性分析取上述1号管3号管菌液400ul分别加入2支EP管中，离心去上清，沉淀用200ulTris重悬。冰水浴超声破碎。离心，上清液取样电泳，沉淀用200ulTris重悬，电泳。Cementprotein可溶性分析检测图3.2如图所示,1-上清1-沉淀3-上清3-沉淀MlOOkd 75kd5Okd32kd2

19、5kd15kd因为蛋白在上清中活性较高，这意味着雷片不施圻怒索高.易行和坤休结合.苑伊昕俎雷白在枇栉高.而15、过夜诱导蛋白图1.2Cementprotein64P-BAl蛋白可溶性分析导。这就是所谓的优先Lanel：对照lane2：1号Lane3：2号lane4：3号Lane5：M4. 3.Cementprotein的分离纯化本实验采用NiTDA亲和层析一步纯化蛋白金团ehtprotein,最终得到的融合蛋白纯度能达到90%以上，Cementprotein的分离纯化检测图lOOkd 75kd50kd32kd25kd15kd图1.3Cementprotein64P-BAl蛋白纯化检测图Lane

20、l：全菌lane2：上清Lane3：流出lane4：20Lane5：50Lane5：250如图所示Lanel为全菌破碎后蛋白条带58KD处有明显表达条带；Lane2为上清中蛋白条带58KD处有明显表达条带；lane3为上清过柱后流出条带；融合蛋白表达条带降低很多，说明融合蛋白大量挂柱；Lane4为20mm咪唾洗涤后流出有杂质和部分融合蛋白洗出；Lane5为50mm咪唾洗涤后流出有杂质和部分融合蛋白洗出；Lane6为250mm咪啜洗脱后流出融合蛋白被大量洗脱，且浓度和纯度很高。5. 4.Cementprotein的WesternbIot检测Cementprotein的WesternbIot检测图

21、图L4Cementprotein的Westernblot检测图如图WesternbIot检测58批婚拈a钠i包南带融流蹶物化得到蛋白为实验预期纯化的融合蛋白。5结论5.1. 本实验利用Ni离子与咪陛基特异的亲和性,使螯和有Xi离子的亲和层析柱可以用来纯化含有组氨酸的融合蛋白，在Cementprotein经过重组后，融合蛋白带上了HIS标签,在纯化时可以特异性结合在层析柱上，用含高味陛的ElutionBuffer溶液使蛋白Cementprotein与杂蛋白分开由电泳的检测结果可知，用这种简单、快捷的一步纯化的方法,能够得到达到电泳纯的蛋白，而HIS标签并不影响蛋白Cementprotein的活性

22、；5.2. 重组后的蛋白Cementprotein虽然很稳定，但在纯化的过程当中还要使蛋白溶液始终保持在低温冰浴的环境中。接触到蛋白的容器一定要灭菌干净，避免杂菌的污染；6. 3.在用IPTG进行诱导表达时先做一个浓度梯度，实验发现终浓度在ImM,温度为37,时间为4h,融合蛋白产生量最多，但易形成包涵体。终浓度为0.5mM,温度为15C,时间为12h,上清中融合蛋白增多。参考文献14赵永芳编著。生物化学技术原理及其应用（第二版）。武汉大学出版社.E2SvenLofdal,BengtGuss,MathiasUhlen,LennartPhi1ipson,andMartinLindberg.geneforStreptococcalProteinG.Proc,Natl,Acad,Sci,USA,Vol.80,pp697-701,Februaryl9833范代娣，沈立新，米珏编著。重组蛋白分离与分析o化学工业出版社，4（德）R.M.Kamp,（德）B,Wittmann-Liebold,（希腊）T.Choli-Papadopoulou。蛋白质结构分析:制备，鉴定与微量测序,北京科学出版社5phyllis»nanodb,蛋白质电泳实验技术6叶