生化实验B讲义汇编

1、合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015生物化学实验B实验讲义实验名称及学时安排编P实验名称学时1蛋白质的沉淀和变性反应42氨基酸的分离和鉴定一双向层析法43总糖和还原性糖的测定一3,5二硝基水杨酸法44*不同分子量蛋白质的分离一凝胶过滤层析法45*SDS-PAG袪测定蛋白质分子量46*DNA勺琼脂糖电泳4*实验1-3是食品科学与工程和化学工程与工艺专业的共有实验；实验4-6为食品科学与工程专业的专有实验。2014-2015（二）生物化学实验B课表生物化学实验课表（14级食品1-5班）周次节次星期一星期二星期三星期四星期五星期六星期日第5周1-41食品1班5-81食品4班7-91食品3

2、班1食品2班7-91食品5班第6周1-45-82食品5班7-92食品1班2食品2班7-92食品3班7-92食品4班第7周1-43食品1班4食品2班5-83食品2班3食品5班7-93食品4班3食品3班4食品1班第8周1-45-84食品4班7-94食品3班4食品5班第9周1-45食品3班5-85食品1班5-95食品4班5-9第10周1-45-85食品2班5-95食品5班5-9第11周1-46食品3班5-86食品1班6食品4班第12周1-45-86食品2班6食品5班1 / 27合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015实验一蛋白质沉淀和变性实验一、实验目的1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认

3、识。2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。4. 了解蛋白质两性性质。二、实验原理在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：1 .可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀

4、反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。2 .不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。三、试剂和器材1.试齐1J(1)蛋白质溶液取5ml鸡或鸭蛋

5、清，用蒸储水稀释至100ml,搅拌均匀后用48层纱布过滤，新鲜配辂。(2)蛋白质氯化钠溶液取20ml蛋清，加蒸储水200ml和饱和氯化钠溶液100ml,充分搅匀后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。(3)蛋白质沉淀试剂硫酸镂粉末,饱和硫酸镂溶液(150ml),3%肖酸银(280ml),0.5%乙酸铅(200ml),浓硫酸(5ml/组)，5麻基水杨酸(100ml),0.1%硫酸铜(100ml),饱和硫酸铜溶液(400ml),0.1%乙酸(500ml),10%乙酸(500ml),饱和氯化钠溶液(25ml),10%R氧化钠溶液(500ml)。2.器材试管，过滤漏斗，试管架，玻璃棒，沸

6、水浴，量筒，烧杯，试剂瓶，移液管，滤纸，洗瓶，废液缸，药匙，移液管架。四、实验步骤3ml蛋白质氯化钠溶液3ml饱和硫酸镂混匀静置10minA静置搅拌至饱和臼A清蛋白沉淀硫酸镂粉末1 .蛋白质的可逆沉淀反应一蛋白质的盐析作用（分级盐析）弃去清液观察一»现象2 .蛋白质的不可逆沉淀反应（1）重金属沉淀蛋白质各5连自 责溶液水一观察沉淀 一A是否溶解过量饱和A硫酸铜4观察沉淀 是否溶解1ml蛋白质溶清滴°i铅观以淀一观察沉淀是否溶解（2）酸沉淀蛋白质1）磺基水杨酸对蛋白质的沉淀作用数35%磺基水杨酸水0.5ml蛋白质溶液观察蛋白质沉淀观察现象2）浓硫酸对蛋白质的沉淀作用、10滴浓

7、硫酸试管6滴蛋白质浴椒观祭两收界浦观祭现象7 / 27合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015（3）加热沉淀蛋白质取5支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位/滴）蛋白质0.1%10%乙饱和氯10%M氧蒸储溶液乙酸酸化钠化钠水110一一一一72105一一一2310一5一一2410一52一一510一一一25将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min,比较各管的沉淀情况。五、思考题1 .蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？2 .简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系实验二氨基酸的分离和鉴定一双向层析法一、实验目的1 .学习双向纸层析的基本原理；2 .掌握双

8、向纸层析法分离氨基酸混合物的方法；二、实验原理纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位谿常用比移值Rf来表示。Rf值=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PHH温度）

9、下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。由于滤纸纤维可吸收2025%勺水分；且其中67%A氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。层析溶剂要求：（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.050.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05,以免斑点重叠。（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。（3

10、）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以苛三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱，如下图所示。r+正丁酹：帖碇；的尤乙醇；水I：1：1H相图1.8种氨基酸混合物双向层析结果图三、试剂和器材1 .试齐1J(1)测试样品：标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50mL0.01M盐酸中。(2)溶剂系统：第一相：正丁醇：88聊酸：水=15：3：2(V/V);第二相：正丁醇：口比咤：95叱醇：水=5：1：1：1(V/V)

11、。(3)显色剂：0.1%(W/V)苛三酮丙酮液。2 .器材层析缸25x40cm(X2);培养皿15cm(X2);喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱；层析滤纸12x12cm；铅笔；尺；针线等。四、实验步骤1 .点样取层析滤纸一张(12x12cm),在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90°,距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处(如下图)点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后,把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铭丝相连（或以针线缝合），但不可重叠相碰。2 .展层在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培

12、养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，用电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90。，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（如下图），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，用电吹风吹尽溶剂使其干燥。剂前沿部分最绛丹离11 / 27A单向上行B双向上有图2.纸层析点样和展层示意图3 .显色用喷雾器将苗三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65c烘箱内，烘30分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂

13、前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。五、思考题1、酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？2、为什么展层时要用两种溶剂系统？合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015实验三3.5-二硝基水杨酸法测定总糖和还原性糖的含量一、实验目的1 .掌握还原糖和总糖的测定原理2 .学习用比色法测定还原糖的方法、实验原理在NaO书口丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸(DNS与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH1性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值

14、呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。(DNS)(3氨基一5一硝圣水杨酸)|黄色橘红色三、试剂和器材1 .材料无糖藕粉和玉米淀粉2 .试齐IJ(1) 3,5二硝基水杨酸(DNS试剂：称取6.5gDNS溶于少量热蒸储水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml,再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。(2)葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg,加少量蒸储水溶解后，以蒸储水定容至100ml,即含葡萄糖为2.0mg/ml。(3)6mol/LHCl:取250ml浓HCl(35338%用蒸储水稀释到500ml。(4)碘-碘化钾溶液：称取5g

15、碘，10g碘化钾溶于100ml蒸储水中。（5） 6NNaOH称取120gNaOH溶于500ml蒸储水中。（6） 0.1%酚酗:指示剂。3.器材托盘天平；量筒（10ml或25ml）;大（小）试管；白瓷板；试管架；移液管；三角漏斗;滤纸；烧杯（400mD；水浴锅；长玻璃棒；分光光度计四、实验步骤1 .葡萄糖标准曲线的制作注意标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色取5支15mm<180mm式管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸储水。2口吕勺葡萄糖标准液/ml蒸储水/ml葡萄糖含量/mgOD40001010.20.80.420.40.60.830.60.41.240.8

16、0.21.65102在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml,于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸储水9.0ml,摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸储水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2 .样品中还原糖的提取准确称取1g无糖藕粉，放在大试管中，先以少量蒸储水（约2ml）调成糊状，然后加入30ml蒸储水，混匀，于50C恒温水浴中保温20min,不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸储水定容至刻度，即为还原糖提取液。3 .样品总糖的水解及提取准确

17、称取0.5g玉米淀粉，放在大试管中，加入6mol/LHCl10ml,蒸储水15ml,在沸水浴中加热0.5h,取出12滴谿于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚配指示剂，以6NNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。4 .样品中含糖量的测定取7支15mm<180mm式管，分别按下表加入试剂:项目空白还原糖总糖H2O/ml10000样品溶液/ml011113,5-二硝基水杨酸试剂/ml22222OD®

18、/540nm加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸储水9.0ml,摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。还原糖毫克数M样品稀释倍数还原糖 =1005 .结果处理样品重量总糖 =水解后还原糖毫克数X样品稀释倍数样品重量100 0.9五、思考题1 .比色时为什么要设计空白管？2 .总糖提取过程中，用盐酸水解玉米淀粉后，为什么要用氢氧化钠溶液进行中和?实验四：不同分子量蛋白质的分离一凝胶过滤层析法一、实验目的1 .了解凝胶柱层析的原理及应用。2 .掌握凝胶柱层析的基本操作技术。二、实验原理凝胶层析又称凝胶过

19、滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离

20、化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（V。）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav=（Ve-Vo）/（Vt-V。）在限定的层析条件下，Vt和V。都是恒定彳1,而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即V。）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖200

21、0测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸俊、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯鱼精蛋白（DNP-鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过SephadexG-25层析后达到分离。三、试剂和器材1 .材料血红蛋白溶液（Hb）:取抗凝血（肝素）2mL离心弃去上层血浆。用0.9%NaCl洗血细胞数次（颠倒混匀，离心，弃去上清液），使离心后上清液几乎无淡黄色为止。于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸储水摇匀，离心去沉淀（破碎的细胞膜等）即为Hb稀释液备用。DNP-

22、鱼精蛋白溶液：取鱼精蛋白0.15g溶于10%NaHCO3§1夜1.5mL中（此时该蛋白质溶液pH应在8.59.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g,溶于微热的95%乙醇3mL中，待其充分溶解后立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管谿于沸水浴中煮沸5分钟，注意防止乙醇沸腾溢出。冷却后加2倍体积的95%乙醇，可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。离心（300r/m）5分钟，弃去上清液，沉淀用95%乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸储水溶解，即为DNP-鱼精蛋白溶液，备用。2 .试齐IJ0.9%NaCl;10%NaHCO3;95%乙醇。pH7.0凝酸缓冲液（20mMB酸二氢钠：20mMB酸氢二钠=31mL:

23、69mL）3 .器材层析柱（1'15cm）;吸管1mL（'1）;滴管；搅棒试管四、实验步骤1 .凝胶溶胀取3克葡聚糖凝胶（SephadexG-25）干粉，浸泡于蒸储水中充分溶胀（室温6小时），或者于沸水浴中煮沸1小时后冷却。充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤23次，最后加入等体积pH7.0磷酸缓冲液备用。2 .装柱取直径1cm,长15cm的玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5-7cm高的磷酸缓冲液，调节流速1滴/10秒；待柱中剩下约0.5cm磷酸缓冲液时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊凝胶一次性倒入柱中，自然沉降20分钟，

24、在此过程中可以看到凝胶均匀地沉降到柱的底部并不断地上升。20分钟后，用镣子小心在胶面上放谿圆片滤纸，用滴管补加缓冲液（注意随时添加缓冲液，防止柱床干裂）。同时开启恒流泵，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。若分次装入凝胶，需用玻璃棒15 / 27合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面分层。装柱长度至少10CR!3 .平衡用磷酸缓冲液冲洗洗脱，平衡20分钟。注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动。4 .样品制备取DNP-鱼精蛋白溶液3滴和Hb溶液1滴混合，即为上柱样品。5 .上样待层析柱上缓冲液几乎全部进

25、入凝胶时，关掉恒流泵，用滴管将上述样品沿柱内壁小心加到床表面，注意尽量不使平整的床表面搅动，然后打开恒流泵，让样品进入柱床。待其将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入磷酸缓冲液至柱顶。6 .洗脱旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每10秒一滴的流速，观察并记录Hb和DNP-鱼精蛋白在层析柱中的位谿，并解释之。待所有有色条带完全流出柱子后，继续洗柱5min。停止恒流泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出滤纸片。7 .注意事项(1)根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗脱缓冲液使其充分溶胀。(2)层析柱粗细必须均匀，

26、柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。(3)各接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。(4)装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。(5)始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。五、思考题1 .凝胶过滤法除了可以进行

27、不同分子量蛋白质的分离，还可以进行未知蛋白质分子量的测定，简述后者的实验原理。2 .影响凝胶过滤层析实验结果的因素有哪些？19 / 27实验五：SDS-PAG法测定未知蛋白质的相对分子量一、实验目的1 .了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理；2 .掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量的方法；二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate

28、）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。三、试剂和器材1 .试齐1J（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mLTris36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL（

29、2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL,Tris5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL(3) 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N,N'-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g,溶于重蒸水中，最后定容至100ml,过滤后谿棕色试剂瓶中，4C保存。合肥工业大学(宣城校区)化工与食品加工系2015(4) 10魅缩胶贮?称Acr10g及Bis0.5g,溶于重蒸水中，最后定容至100mL过滤后谿棕色试剂瓶中，4c贮存。(5) 10%SD箭液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。(6) 1%TEMED(7)

30、 10%过硫酸钱(AP):现用现配。(8)电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3):称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,SDS1.0g,用无离子水溶解后定容至1L。(9)样品溶解液：取SDS100mg,前基乙醇0.1mL,甘油1mL澳酚蓝2mg0.2mol/L,pH7.2磷酸缓冲液0.5mL,加重蒸水至10mL(遇液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解标准蛋白质及待测固体。(10)染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250,加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。(11)脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。2 .器材垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或10

31、06微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。四、实验步骤1 .安装夹心式垂直板电泳槽目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设谿略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。2 .配胶根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAG环连续系统,按下表的配制分离胶和浓缩胶。试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.50%10%15%3%分离胶贮液3.3356.6610-(30%Acr-0.

32、8%Bis)分离胶缓冲液2.52.52.52.5-(pH8.9Tris-HCl)浓缩胶贮液-3(10%Acr-0.5%Bis)浓缩胶缓冲液-1.25(pH6.7Tris-HCl)10%SDS0.20.20.20.20.11%TEMED22222重蒸储水11.8710.28.545.24.6混匀后，谿真空干燥器中，抽气10min10%AP0.10.10.10.10.053 .制备凝胶板(1)分离胶制备：按表配制20ml10%离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸储水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约34mnW,以进行水封。约30min后，凝胶与水

33、封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸储水，再用滤纸条吸去多余水分。(2)浓缩胶的制备：按表配制10ml3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放谿2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。4 .样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.51mg/mL,沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。

34、处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。21 / 27合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015一般加样体积为1015科L（即210科g蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。5 .电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA待样品进入分离较时，将电流调至20 30mA当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。21 染色及脱色将染色

35、液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸储水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。22 计算（1）相对迁移率mR=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）（2）以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。8.注意事项（1）不是所有的蛋白质都能用SDS檄胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1,它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS仍

36、不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS檄胶电泳测定白结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。（2）有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如“-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS萌基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS檄胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。五、思考题1 .SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同？2 .用SDS-

37、凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用萌基乙醇？3 .用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所不同？是否所有的蛋白质都能用SDS箍胶电泳法测定其分子量？为什么？23 / 27实验六：质粒DNA艮制性酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定一、实验目的1 .了解DNA的限制性酶切原理；2 .掌握琼脂糖凝胶电泳法的基本操作技术。二、实验原理1 .DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA它可分为三类：I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于A

38、TP的存在。III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA而出类酶在识另1J位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。n类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核甘酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。n类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA勺基础。绝大多数n类限制酶识别长度为4至6个核甘酸的回文对称特异核甘酸序列（如EcoRI识别六个核甘酸序列:5'-GJAATTC-3'）,有少数酶识别更长的序列或简并序列。n类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如Smal:5'

39、-CCCJGGG-3'）;有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA段称粘性未端，如EcoRI切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'-0AATTC-3'-5'GAATTC-3'3'CTTAA?G-5'-3'CTTAAG-5'DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位谿确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DN附列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA勺无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）

40、技术更是建立在它的基础上。2 .凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA段。当用低浓度的荧光嵌入染料澳化乙咤(Ethidiumbromide,EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA段在凝胶中的位谿。此外，还可以从电泳后的凝月中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNM阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：(1)DNA的分子大小：线状双链DN后子

41、在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DN肪子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。(2)琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。(3)DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超

42、螺旋DNAE琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA动最快，而线状双链DNA动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA(4)电源电压在低电压时，线DDNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DN*段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加

43、电压不得超过5v/cm。(5)嵌入染料的存在荧光染料澳化乙咤用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA使其刚性更强，还会使线状DNAf移率降低15%(6)离子强度影响合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸储水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中（如误加10X电泳缓冲液），则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。三、试剂与器材1 .材料入DNA:购买或自行提取纯化；重组pUC19质粒;EcoRI酶及其酶切缓冲液；Hind

44、出酶及其酶切缓冲液；琼脂糖（Agarose）。2 .试齐IJl0xTBE缓冲溶液（0.89mol/LTris-0.89mol/L硼酸-0.025mol/LEDTA缓冲溶液广取108gTris,55g硼酸和9.3gEDTA（EDTANa22H20）溶于水，定容至1000mL调pH8.3。作为电泳缓冲溶液时应稀释10倍。6X电泳加样缓冲液：0.25%澳粉蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液，贮存于4C。澳化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。3 .器材电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液枪，微波炉，琼脂糖凝胶成像系统。四、实验步骤1 .DNA酶切

45、反应（1）用微量移液枪向灭菌的eppendorf管分别加入DNA1科g和相应的限制性内切酶反应10X缓冲液2科L,再加入去离子水使总体积为19科L,将管内溶液混匀后加入1科L酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。（2）混匀反应体系后，将eppendorf管谿于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37C水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。（3）每管加入2dL0.1mol/LEDTA（pH8.0）,混匀，以停止反应，谿于冰箱中保存备用。2 .DNA分子量标准的制备采用EcoRI或Hindm酶解所得的入DNA片段来作为电泳时的分子量标准。入DNA为长度约50kb的双链DN6子，其商品溶液浓度为0.5mg/mL,酶解反应操作如上述。HindIII切割DNA得到8个片段，长度分别为23.1