高效液相色谱法同时测定动物组织中16种苯并咪唑类药物残留_百(精)

1、231分析检测 食品科学2011, Vol. 32, No. 02高效液相色谱法同时测定动物组织中16 种苯并咪唑类药物残留林海丹 ,林 峰,张美金 ,谢守新 ,吴映璇 ,邵琳智 ,姚仰勋(广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广东 广州 510623摘要 :建立同时测定动物组织中16 种苯并咪唑类药物及其代谢物多残留的高效液相色谱分析方法。试样经乙酸 乙酯、 50g/100mL 氢氧化钾溶液、1g/100mL BHT 溶液 (20+0.15+1, V/V 提取后 ,正己烷脱脂 , MCX 固相萃取柱 净化 ,用高效液相色谱 C 18 柱分离 ,乙腈 -0.025mol/L 乙酸铵作为流动相

2、,流速为 1.0mL/min, 梯度洗脱 ,紫外检 测波长为 292nm ,外标法峰面积定量。 16 种苯并咪唑类药物在0.0251.0mg/L 质量浓度范围内线性良好,相关系 数 r 均大于 0.99,动物组织样品在10、 50、 100 g/kg添加水平的添加回收率在81.6%110%之间 ,相对标准偏差为1.8%13.1%(n =10,方法的定量限为10 g/kg。方法灵敏度高、重现性好,适用于动物组织中苯并咪唑类药物多残留的检测。关键词 :高效液相色谱 ;动物组织 ;苯并咪唑类药物Simultaneous HPLC Determination of 16 Benzimidazoles

3、Residues in Animal TissueLIN Hai-dan, LIN Feng, ZHANG Mei-jin, XIE Shou-xin, WU Ying-xuan, SHAO Lin-zhi, YAO Yang-xun(Inspection and Quarantine Technology Center, Guangdong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, ChinaAbstract :A high performance liquid chromatography (HPLC me

4、thod was developed for the simultaneous determination of16 benzimidazoles residues in animal tissue. Animal tissue samples were extracted with ethyl acetate-50% potassium hydrox-ide-1% BHT (20:0.15:1, V/V , followed by treatment with n-hexane for defatting and further clean-up on MCX solid phase (SP

5、Ecartridge. The chromatographic separation was performed on a C18 column with a mobile phase consisting of acetonitrile and0.025 mol/L ammonium acetate solution at a flow rate of 1.0 mL/min by gradient elution. Detection wavelength was set at 292nm, and the quantitation method used was external stan

6、dard method. The calibration curves of 16 benzimidazoles exhibited goodlinearity over a concentration range from 0.025 to 1.0 mg/L, with correlation coefficients above 0.99. The average recoveries for16 benzimidazoles in meat and liver tissues from threedifferent animal species ranged romf 81.6% to

7、110% at spike levels of 10,50 g/mL and100 g/mL, and the relative standard deviations were between 1.8% and 13.1% (n = 10.The limit of quantificationwas 10 g/kg. This method is sensitive, reproducible andsuitable for the determination of benzimidazoles in animal tissue.Key words:highperformance liqui

8、d chromatography; animal tissue; benzimidazoles中图分类号 :O657.72 文献标识码 :A 文章编号 :1002-6630(201102-0231-06收稿日期 :2010-03-05作者简介 :林海丹 (1972 ,女,高级工程师 ,硕士 ,主要从事食品中兽药残留和食品添加剂检测研究。 :苯并咪唑类药物 (benzimidazoles是一种驱虫药 ,对 线虫、绦虫、吸虫都具有强的驱杀作用 ,在兽医临床 上应有广泛。苯并咪唑类药物的结构中均含有苯环和咪 唑的 C-4 和 C-5 稠合而成的双环体系。在苯并咪唑母核 的 C-2 和 C-5 位置含

9、有不同的取代基衍生出具有驱虫作用 的药物。根据 C-2 位取代基的不同将苯并咪唑类药物分 为噻苯咪唑类和氨基甲酸酯两类。常用的苯并咪唑类药物包括阿苯咪唑、奥芬达唑、芬苯达唑、氟苯咪唑、 甲苯咪唑、噻苯咪唑和丙氧苯咪唑。由于一些苯并咪 唑类药物及其代谢物在动物和靶动物安全评价实验中表 现出致畸和致突变的作用 ,许多苯并咪唑类药物在体内 很快代谢 ,一些代谢物 , 如亚砜化物、羟化产物等仍 具有胚胎毒性 ,因此许多国家已将苯并咪唑类药物和其代谢物同时作为监控对象。美国、日本等国家和组织2011, Vol. 32, No. 02 食品科学 分析检测 232都将苯并咪唑类药物列入限制使用的兽药药物中,

10、并制 订出各种苯并咪唑类驱虫药物 (包括其某些代谢物在不同 动物体内 (包括肌肉、组织等的最高残留限量MRL , 在 不同的动物和不同的组织中最大残留限量从10 g/kg到 5mg/kg 不等 ,大多数限量是 100g/kg。欧盟和我国规 定阿苯达唑的残留标识物是阿苯达唑以及其代谢物阿苯 达唑 -2-氨基砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑砜 ;奥芬达 唑、芬苯达唑的残留标识物是它们的代谢物奥芬达唑 砜 ;氟苯咪唑的残留标识物事其代谢物是 2-氨基氟苯咪 唑;甲苯咪唑的残留标识物是其等效物 ;丙氧苯咪唑的 残留标识物是其原形 ; 噻苯咪唑的残留标识物是噻苯咪 唑及其代谢物 5-羟基噻苯咪唑。目前 ,国内

11、外报道的动物组织中苯并咪唑类药物残 留分析的方法主要涉及有高效液相色谱和液相色谱串联 质谱法 1-10 。国内的研究主要以原药为目标物 ,有关代 谢物的研究多数只涉及一两种组分的分析方法。 Balizs 11 报道了 15 种苯并咪唑类药物及其代谢物的 LC-MS/MS 方 法,但其大多数目标物的回收率偏低。本研究旨在建 立目前我国有规定最大残留量的 16 种苯并咪唑类药物及 其代谢物多残留的液相色谱方法 ,对 16 种苯并咪唑类药 物残留分析的提取方法、净化方法和色谱条件进行系统 的研究 ,为动物组织中该类药物的残留监控提供了可靠 的技术支持。1材料与方法1.1 材料与试剂动物组织 送检样品

12、。甲醇、乙腈 (HPLC 级 美国 Tedia 公司 ;正己 烷、乙酸乙酯、N , N -二甲基甲酰胺 (DMF 、氢氧化钾、 盐酸、浓氨水 (25%28%、乙酸铵、无水硫酸钠 (均 为分析纯 广州分析试剂厂 ; 2,6-二叔丁基对甲酚 (BHT, 纯度 99% 德国 Sigma 公司 ; Mill-Q超纯水。 标准品 :奥芬达唑 (Oxfendazole, CAS 号 53716-50-0 、芬苯达唑(Fenbendazole, CAS号 43210-67-9 、阿 苯达唑 (albendazole, CAS号 54965-21-8 、阿苯达唑 -2-氨基砜 (Albendazole-2-a

13、minosulfone, CAS 号 80983-34-2 、阿苯达唑亚砜 (Albendazole sulfoxide, CAS 号 54029-12-8 、阿苯达唑砜 (Albendazole sulfone, CAS 号 75184-71-3 、甲苯咪唑 (Mebendazole, CAS 号 31431-39-7 、 丙氧苯咪唑 (Oxibendazole, CAS 号 20559-55-1 、噻苯咪 唑 (Thiabendazole, CAS 号 148-79-8 、5-羟基噻苯咪唑 (Thiabendazole-5-hydroxy, CAS 号 948-71-0 、噻苯咪 唑酯 (

14、Cambendazole, CAS号 26097-80-3 、氟苯咪唑 (Flubendazole, CAS 号 31430-15-6 德国 Dr. Ehrenstofer公司 ;氨基甲苯咪唑 (Mebendazole-amine, CAS号 52329-60-9 、羟基甲苯咪唑 (5-Hydroxymebendazole, CAS 号 60254-95-7 、 2-氨基氟苯咪唑 (2-Aminoflubendazole, CAS 号 82050-13-3 德国 Witega 公司 ;奥芬达唑砜 (Oxfendazolesulfone , CAS 号 54029-20-8 英国 Edinbur

15、gh Pharmaceutical Processes公司 ;标准品含量均 在 98%以上。1.2 仪器与设备高效液相色谱系统 (配有 Waters515泵, 717 自动 进样器 , 2487 双通道紫外检测器及 Empower 色谱工作 站 美国 Waters 公司 ; T25 匀浆机、 MS3 涡旋振荡 器 德国 IKA 公司 ; 3-16PK 离心机 德国 Sigma 公 司; Labrota 4003 减压旋转蒸发仪 德国 Heidolph 公司 ; Mill-Q 超纯水器 美国 Millipore 公司。标准 品用乙腈 -水 (2:8, V/V 配成适当浓度的混合标准工作 溶 液

16、。1.3 样品前处理称取 5g 样品 ,于 50mL 离心管中 ,加入 20mL 乙酸 乙酯、 0.15mL 50g/100mL 氢氧化钾溶液和 1mL 1g/100mL BHT 溶液置超声波水浴中振荡 5min ,加入 1g 无水硫酸 钠,均质器上匀质提取 30s , 4000r/min离心 5min ,清 液转移至 100mL 梨形瓶中 ;另取一离心管 ,加入 20mL 乙酸乙酯、 0.15mL 50g/100mL 氢氧化钾溶液和 1mL1g/100mL BHT 溶液洗涤均质器刀头 ;用玻棒捣碎离心管中的沉淀 ,加入上述洗涤均质器刀头的洗刀头液溶液 , 在涡漩振荡器上振荡 2min ,置超

17、声波水浴中振荡 5min , 4000r/min 离心 5min ,清液合并至 100mL 梨形瓶中 , 38 减压旋转蒸发至干。上述残渣立即用 1.5mL 乙腈溶解 ,涡旋混匀 ,超 声 5min ,加入 1.5mL 0.1mol/L 盐酸 ,涡旋混匀 ,转移 到 15mL 离心管 ,加 5mL 正己烷洗涤梨形瓶 ,合并转移 到离心管中 , 涡旋混匀 , 4000r/min 离心 5min ,弃上层 正己烷层 ,加入 3m L 正己烷重复操作一次。脱脂后的样液加入 3mL 0.1mol/L 盐酸 ,涡旋混匀 , 注入已预先用处理的 5mL 甲醇活化、 5mL 0.1mol/L 盐酸 平衡 M

18、CX 固相萃取柱 ,依次用 5mL 0.1mol/L 盐酸、 5mL 甲醇淋洗 , 15mL 浓氨水 -乙腈 (1:9, V/V 溶液洗脱 ,洗 脱液 38减压旋转蒸发至干 ,残渣加入 0.5mL 乙腈 ,置 超声波水浴中振荡 2min 溶解残渣 ,加入 1.5mL 0.025mol/L 乙酸铵涡旋混匀 ,过 0. 45 有m机滤膜 ,供液相色谱 测 定 。1.4 色谱条件色谱柱 :Discovery C18 柱 (250mm4.6mm , 5 m流;动相 :乙腈 -0.025mol/L 乙酸铵 ,梯度洗脱 ;乙腈 : 20%55%(30min 内线性增加 , 55%保持 2min , 55%

19、 20%(0.1min内线性递减 , 20%保持 8min ;流速 :1.0mL/ min ; 柱温 :35;进样量 :40 L检;测波长 :292nm 。233分析检测 食品科学 2011, Vol. 32, No. 022结果与分析2.1 提取条件的优化提取溶液的优化苯并咪唑类药物 (BZs 分子基本上是中等极性分子 , 其水溶度很小 ,考虑到乙酸乙酯和二氯甲烷的极性与 B Z s 接近 ,对 B Zs 溶解能力较强 ,分别对乙酸乙酯、 二氯甲烷提取 BZs 的提取效率进行实验。实验表明二氯甲烷提取BZs ,回收率低于 50%;乙 酸乙酯的提取效率较理想。BZs 是弱碱性化合物 , pH

20、值对具有弱碱性的物质的溶解性或分配系数影响很大 , 调节 pH 值使待测组分在水相中处于中性分子状态 ,或 达到两性分子的等电点 ,水溶性降低 ,易被有机溶剂 萃取。基于以上原理考虑用碱性乙酸乙酯提取 BZs ,实 验表明回收率有较大提高。因此确定碱性乙酸乙酯作为 提 取 溶 液 。提取溶液 pH 值的优化考察碱性乙酸乙酯的提取效率。分别以20m L 乙 酸乙酯不加碱液、加0.5mL50g/100mL KOH 、 0.2mL 50g/100mL KOH 、 0.4mL 50g/100mL KOH 作对比实验考察提取溶剂 pH 值对苯并咪唑药物在动物组织中的提取效率,实验结果表明提取溶剂 pH

21、值对阿苯哒唑、丙氧苯 咪唑的提取效率无明显影响 ,随着 pH 值增大 ,其他苯并咪唑药物的提取效率提高 ,但 pH 值太高 (较高碱液浓 度 , 0.4mL 50g/100mL KOH时 ,噻苯咪唑酯、芬苯达 唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、奥芬达唑砜、噻苯咪唑、 5-羟基噻苯咪唑提取效率下降一半 ,阿苯达唑 -2-氨基 砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜的提取回收率下降至 10%以下。综 合 考 虑 选 择 提 取 溶 剂 每 20m L 乙 酸 乙 酯 加 入 0.15mL 50g/100mL 的氢氧化钾。抗氧化剂对提取效率的影响部分苯并咪唑类药物在样品前处理过程中易发生氧 化反应而致损失 ,实验在样品

22、提取中加入抗氧化剂以保 护分析物 ,分别考察不同质量浓度的 BHT 溶液 ,实验 结果表明加入 1g/100mL BHT 可明显提高奥芬达唑、奥 芬达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜的提取效率 , 对噻苯咪唑、甲苯咪唑的回收率也有好的影响。 2.2 净化条件的优化样品用碱性乙酸乙酯提取,由于乙酸乙酯属于中等极性溶剂 ,有可能提取出类脂物 ,因此提取浓缩后需 去除类脂物。采用乙腈 -正己烷液液分配脱脂。乙腈与 正己烷有一些互溶性 ,会产生轻度乳化 ,考虑加水以 增加乙腈相比重 ,避免乳化现象 ,兼顾到苯并咪唑类 药物的弱碱性 ,其在酸性溶液中溶解度大,因此最后 采用乙腈 -0.1mol/L HCl

23、- 正己烷液液分配脱脂。单纯的液液分配法很难确保色谱分析时不出现基质干扰。固相萃取是一项样品前处理的新技术。考虑到 BZs 的弱碱性 ,选择 Waters Oasis MCX 固相萃取柱进 行实验 ,该固相萃取柱为阳离子交换 -反相吸附剂 ,对 碱性物质有高选择性 ,获得本底更干净的提取物。兼 顾到动物样品成分复杂 ,特别是动物肝脏样品 ,为防 止样品过载导致回收率下降 ,选用大体积高容量的 150mg/6cc 的 MCX 柱。对固定萃取柱的活化、样品上 柱、洗涤和洗脱条件进一步实验。以 0.1mol/L 盐酸溶 液稀释样品液 ,使分析组分带正电荷而被固相萃取柱保 留。洗涤是除去不需要的组分或

24、杂质 ,经筛选实验确 定以 5mL 0.1mol/L 盐酸溶液和 5mL 甲醇溶液作为洗涤溶 剂除去干扰物而苯并咪唑药物仍有高回收率。调节洗脱 溶剂 pH 值为碱性以使苯并咪唑类药物保持非离子状态或 反离子状态不被保留从而从柱子上洗脱下来。采用氨 水 -乙腈溶液作为洗脱溶剂。实验中依次增加氨水含量的乙腈溶剂体系进行洗脱实验,实验结果表明采用浓氨 水 -乙腈溶液 (1:9, V/V 为洗脱溶液可使苯并咪唑类药物 充分洗脱 ,同时浓氨水 -乙腈溶液 (1:9, V/V 洗脱液的体 积淋洗实验 ,结果表明大于 12mL 时可以淋洗完全。最 后选择 15mL 浓氨水 -乙腈溶液 (1:9, V/V 作

25、为洗脱溶剂。 2.3 色谱条件的优化1.5-羟基噻苯咪唑 ; 2. 阿苯达唑 -2-氨基砜 ; 3. 阿苯达唑亚砜 ; 4. 噻苯 咪唑 ; 5. 阿苯达唑砜 ; 6. 奥芬达唑 ; 7. 氨基甲苯咪唑 ; 8. 羟基甲苯咪 唑; 9.2-氨基氟苯咪唑 ; 10. 噻苯咪唑酯 ; 11. 奥芬达唑砜 ; 12. 丙氧 苯咪唑 ; 13. 甲苯咪唑 ; 14. 氟苯咪唑 ; 15. 阿苯达唑;16.芬苯达唑。图116种苯并咪唑类药物标准的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of 16 bemzimidoles standards 0.004 0.0020.0001AU时间

26、 /min2345678910111312141516对于残留分析 ,由于各组分性质有别 ,为得到适 宜的保留值和最佳峰形需采用梯度洗脱。 BZs 属有机碱 化合物 ,水溶性极小。反相HPLC 分析时硅胶基键合相表面残余的酸性硅醇基能强烈吸附BZs ,导致保留时间过长、峰拖尾或变形。为降低游离硅醇基的二次吸附作用和增加 Bzs 在流动相中的溶解性 ,需采用调节 pH(离 子增强法 和较高的比例的有机溶剂等方法优化流动相。经筛选采用离子增强流动相体系 ,以乙腈 -0.025mol/L 乙酸铵溶液进行梯度洗脱 ,分别考察 C lo v ersi l C 18、 O R2011, Vol. 32,

27、No. 02食品科学分析检测234 名称 线性方程 相关系数 名称 线性方程 相关系数 5-羟基噻苯咪唑 y=1.30 105x -2880.99982-氨基氟苯达唑 y =7.38 104x -1770.9999 阿苯达唑 -2-氨基砜 y =1.47 105x -2410.9998 噻苯咪唑酯 y =1.08 105x -3160.9999 阿苯达唑亚砜 y =1.42 105x -2020.9998奥砜达唑砜 y =1.23 105x -2950.9998噻苯达唑 y =2.49 105x -7880.9998 丙氧苯咪唑 y =5.49 104x -1570.9999 阿苯达唑砜 y

28、=1.30 105x -2210.9998 甲苯咪唑 y =1.14 105x -4180.9999 奥砜达唑 y =1.41 105x -2750.9998 氟苯咪唑 y =9.19 104x -3860.9999 氨基甲苯咪唑 y =8.62 104x -3060.9999阿苯达唑 y =7.85 104x -3860.9999羟基甲苯咪唑y =1.45 105x -2730.9998芬苯达唑y=1.22 105x -9550.9999表116种苯并咪唑类药物的线性方程和相关系数Table 1 Linear equations and correlation coefficient of

29、16 benzimidazoles名称 加入量 / 猪肉 猪肝 鸡肉 鸡肝 牛肉 牛肝 ( g/kg回收率 /%RDS/%回收率/%RDS/%回收率 /%RDS/%回收率 /%RDS/%回收率 /%RDS/%回收率 /%RDS/%5-羟基噻苯咪唑阿8苯达唑 -2-氨基砜阿0苯达唑亚砜噻8苯达唑阿5苯达唑砜奥9砜达唑氨1基甲苯咪唑羟9基甲苯咪唑氨-基氟苯达唑噻1苯咪唑酯奥9砜达唑砜丙5氧苯咪唑甲8苯咪唑氟4苯咪唑阿1苯达唑芬9苯达唑1034.199.97.21017.896.34.796.84.995.54.5表 2 不 同 基 质 样 品 中 16 种 苯 并 咪 唑 类 药 物 的 添 加

30、回 收 率 结 果 (n =10Table 2 Spkie recoveries for 16 benzimidazoles in different matrices (n = 10235分析检测 食品科学2011, Vol. 32, No. 02Discovery C18 等色谱柱 ,经实验筛选并优化确定的液相 色谱条件是 :Discovery C 18 柱,乙腈 -0.025mol/L 乙酸 铵溶液梯度洗脱 ;乙腈 :20%55%(30min 内线性增 加 , 55%保持 2min , 55%20%(0.1min 内线性递减 , 20%保持 8min 。流速 :1.0mL/min 。在该

31、条件下的 16 种苯并咪唑类药物的液相色谱图见图 1。 2.4线性范围以峰面积 -质量浓度作校正曲线 ,得到线性回归方程, 16 种苯并咪唑类药物在 0.0251.0mg/L 范围内线性关系良好 ,相关系数均大于 0. 99,线性方程见表 1。 2.5回收率、精密度与定量限选用不含苯并咪唑类药物的鸡肉、猪肉、牛肉、鸡肝、猪肝和牛肝样品分别加入10、 50、 100g/kg的16 种苯并咪唑类药物 ,按建立的方法处理样品 ,分析 测定并计算其进行回收率和精密度 ,测得平均回收率 (n =10 在 81.6%110%之间 ,相对标准偏差为 1.8%13.1%,结果见表 2,各基质的空白和加标样品的

32、液相 色谱图见图 27。实验表明不同基质样品中 16 种苯并 咪唑类药物在添加 10g/kg水平时 ,信噪比 (R SN 均大于 10,且回收率和精密度满意 ,因此以 10g/kg作为方 法的定量限。图 5鸡 肝 空 白 样 品 (A 和 加 标 (10 g/kg样 品 (B 的 液 相 色 谱 图Fig.5 HPLC chromatograms of blank chicken liver andspiked chicken liverAA U时间 /min51015202530350.002AA U时间 /min5101520253035图 3 猪 肝 空 白 样 品 (A 和 加 标 (

33、10 g/kg样 品 (B 的 液 相 色 谱 图 Fig.3 HPLC chromatograms of blank pork liver and spiked pork liver0.0020.0010.000BA U时间 /min512345678910111213141516图 2 猪 肉 空 白 样 品 (A 和 加 标 (10 g/kg样 品 (B 的 液 相 色 谱 图 Fig.2 HPLC chromatograms of blank pork and spiked pork(at 10 g/kg, the same as Fig.3 through 70.000BA U时间

34、/min5101520253035123456789101112131415160.0020.0010.000AA U时间 /min0.0020.0010.000BA U时间 /min510152025303512347810131415165691112 图 4鸡 肉 空 白 样 品 (A 和 加 标 (10 g/kg样 品 (B 的 液 相 色 谱 图Fig.4 HPLC chromatograms of blank chicken meat andspiked chicken meatBA U时间 /min510152025303512345678101213141516A U时间 /m

35、in102030236 2011, Vol. 32, No. 02 A 食品科学 3 结0.000 0 5 10 15 20 25本方法同时测定动物组织论 分析检测 0.004 AU 0.00216 种苯并咪唑药物及其代谢物，方法的回收率和精密度符合SN/T 0005 1996出 口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编 12 写的基本规定，方法的定量限符合各国对苯并咪唑30 35 类药物监控的要求。方法实用、准确，为动物组织中苯并咪唑类药物的监控提供可靠技术支持。时间 /min 0.004 AU 0.002 4 56 89 11 13 1 23 7 10 12 14 150.000

36、0 5 10 15 20 25 16 B参考文献： 1 张素霞 , 李俊锁 , 钱传范 . 牛肌肉组织中苯并咪唑类药物的基质固 相分散 - 高效液相色谱多残留分析法 J. 中国兽医学报 ,2000, 20 (6: 569-571. 2 陈毓芳 , 彭肖颜 . 反相高效液相色谱法同时测定动物组织中苯并咪 唑类兽药残留量 J. 光谱实验室 , 2001, 18(5: 675-378. 张素霞 , 沈建忠 , 丁双阳 ,等 . 牛肝中苯并咪唑类药物残留的高效液相色谱检测方法 J.中国兽药杂志 , 2005,39(6: 18-21. 4 5 张英宣 . 高效液相色谱法测定牛肌肉中苯并咪唑类药物残留的研究 J. 畜禽业 , 2006(10: 6-7. 于慧娟 , 惠芸华 , 黄冬梅 , 等. 反相离子对液相色谱法测定欧洲鳗鲡 体中丙硫咪唑及其代谢物的残留量J. 分析科学学报 , 2008, 24(6: 673-676.6 廖碧釵 , 樊海平 , 余培建 , 等. 欧洲鳗鲡