益气养阴、消症通络中药对大鼠肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的影响

1、益气养阴、消通络中药对大鼠肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的影响作者：张江华陈志强孙玉凤1赵雯红王月华王会青李玉梅【摘要】口的探讨益气养阴、消藏通络中药药物血清对大鼠系膜细胞细胞外基质(ECM)不同成分的抑制作用。方法以体外培养大鼠肾小球系膜细胞及血清药理学方法为基础，采用幅联免疫吸附试验检测ECM中纤维连接蛋口(FN)、层黏连蛋白(LN)、IV型胶原(ColIV)的含量。结果FN、ColIV的含量均增加，而益气养阴、消通络中药对其具有明显抑制作用。结论益气养阴、消通络药物能够减少ECM的积聚，可能是其防治肾小球硬化的机制之一。【关键词】系膜细胞；益气养阴、消藏通络；层黏连蛋口；纤维连接蛋白；IV

2、型胶原；细胞外基质AbstractObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectofherbofsupplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollateralsonthemesangialcells(MCs)secretingextracellularmatrix(ECM)?MethodsBasedonthemethodofculturingMCsinvitroandserumpharmacology,thecontentsoffibronectin(FN),laminin(LN)andc

3、ollagenIV(ColIV)inECMweredetectedbyELISA.ResultsThecontentsofFN,LN,CollinECMwereallincreased,whileinhibitedbyherbofsupplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollateralssignificantly.ConclusionsHerbofsupplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollateralscandecreasetheaccumu

4、lationofECM,whichmaybeoneofthemechanismsofpreventingglomerulosclerosisKeywordsMesangialcells;Supplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollaterals;Laminin:Fibronectin;CollagenIV;Extracellularmatrix糖尿病肾病（DN）基本病理改变为早期肾小球毛细血管球肥大，基底膜（GBM）增厚，细胞外基质（ECM）进行性积聚。ECM的产生增加和（或）降解减少被认为是ECM积聚的主要原因。系膜

5、细胞产生ECM的能力最强。ECM的主要成分是层黏连蛋白（LN）胶原纤维（ColIV）.纤维连接蛋白（FN）及蛋白多糖,因此，LN和FN、ColIV可作为研究小早期病理变化的重要指征（1）。本研究主要针对原代培养的大鼠系膜细胞ECM进行检测，探讨消通络中药对小的保护作用，为DN临床治疗提供依据。1材料与方法地龙、水蛭、鳖甲、大黄、砂仁等组成，水煎、过滤、浓缩按成人剂量的15倍制成含生药0?7g/ml）,111河北医科大学附属河北省中医药中药房提供。厄贝沙坦片（安博维），150mg/片，用时按成人用量15倍用水溶解，配制成含药浓度为1?88g/ml药液，杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产，批号

6、0809155c血管紧张素II（AngII）、胰蛋白幅、IV型胶原幅、Hepes（美国Sigma公司），RPMI1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（澳大利亚PAA公司），EDTA（美fflAmresco公司）。318MC型幅标仪（上海三科仪器有限公司）；低速离心机（北京医用离心机厂），C02恒温培养箱（日本三洋电机株式会社）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；超净工作台（北京半导体设备厂）。1. 2方法1.1.1 实验血清的制备健康SD大鼠36只，SPF级，体重180?220g雌雄兼用，山河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号：905042c将动物随机分为3组，正常组、中

7、药组及厄贝沙坦组。正常组给予相应剂量的蒸憎水，其余各组按每次4皿灌置给药，每日2次，连续3do最后1d2次给药时间间隔为2h,于末次给药后1?2h,用3%戊巴比妥（1.5ml/kg体重）腹腔麻醉大鼠，股动脉取血，3000r/min离心10min分离血清，56C水浴中灭活30min,0.22Um微孔滤膜过滤，-20C冷藏备用。1.1.2 实验分组分为正常组：RPMII1640培养液中含5%胎牛血清+5%正常大鼠血清；高糖组：培养液含有D葡萄糖浓度25mmol/L+5%胎牛血清+5%正常大鼠血清；高糖+AngI组：培养液含有D葡萄糖浓度25mmol/L+5%胎牛血清+5%正常大鼠血清+AnglI1

8、0-6mol/L;厄贝沙坦组：培养液含有D葡萄糖浓度25mmol/L+5%胎牛血清+Ang1110-6mol/L+5%厄贝沙坦血清；中药组：培养液含有D葡萄糖浓度25mmol/L+5%胎牛血清+AngI10-6mol/L+5%中药血清。1.1.3 系膜细胞的培养正常Wistar大鼠，体重75?100g,断颈处死后，清洁取肾，分离皮质、髓质。皮质被剪成碎屑，依次通过100,140,200L1筛网，收集肾小球，IV型胶原酶溶液消化，当细胞分散成单个时,用胎牛血清终止消化，加适量培养基吹匀接种于含20%的胎牛血清、10万U/L青霉素、100g/L链霉素的RPMI1640培养基中，5%C02、37C培

9、养箱培养。当细胞长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。第5?7代细胞用于实验。1.1.4 系膜细胞鉴定形态学及功能鉴定。1.1.5 系膜细胞上清的收集取传代培养的系膜细胞，吸去培养液，用DHanks液洗涤培养瓶2次，然后加0.25%胰蛋口幅/0.02%EDTA4ml,放入培养箱中，37C消化数分钟，之后加入含20%FCS1640液5ml终止消化，4、1000r/min,离心5min,充去上清，加入培养液以1X104/孔接种于48孔培养板中，常规培养24h,使细胞贴壁。更换无血清1640培养液，继续培养24h使细胞同步于G0/G1期，吸充培养板内培养液，按实验分组加入各自不同条件培养液

10、，继续培养72h,终止培养，收集培养上清液，-80C低温冰箱保存待测。1.1.6 培养的上清FN、LN、ColIV的含量检测采用ELISA法检测,严格按说明书操作步骤进行。1.3统计学分析数据以xb表示，用SPSS13.0B计软件进行多组数据间比较用方差分析。2结果2.1 系膜细胞的鉴定倒置显微镜下观察其典型的形态学特征：培养18d后,贴壁的肾小球周圉长出梭形或星形特点的细胞,随着时间延长，细胞铺满瓶底，见图1；功能鉴定：在细胞上滴加血管内皮素后，细胞呈强烈的收缩反应，山梭形、星形或不规则形变为圆形;超微结构观察:透射电镜下GMC也成星形或梭形，胞质内有少量分布的线粒体、粗面内质网、高尔基复合

11、体外，还有最为特征性的是位于胞膜下和细胞突起向内的微丝结构，核居中央，多呈圆形或卵圆形,核染色质较为稀疏，见图2。2.2 各组细胞上清液中LY、及ColIV的表达高糖组系膜细胞分泌FN、LN和ColIV量明显增加，与正常组比较有非常显著性差异(P0.01);与高糖组相比,高糖+AngII组系膜细胞分泌FN、LN和ColIV量显著增加(P0.01);厄贝沙坦组与中药组均能明显降低FN、LN和ColIV的分泌量(P0.05,P0.01再高糖+Angl【组比较有非常显著性差异(P0.05)。表1LN、FN及ColIV含量的比较与正常组比较:l)P0.05,2)P0.01;与高糖组比较:3)P0.05

12、,4)P0.01;与高糖+AngII组比较：5)P0.013讨论肾小球系膜细胞过度增殖引起ECM合成的增加，是肾小球硕化发生、发展的重要机制，亦是造成肾脏功能进行性损害的重要环节(2)。高糖活化系膜细胞内的某些信号通路，如AngII以及炎症细胞因子等的活化，导致FN、LN和ColIVmRNA转录增加、分泌增多以及肾小球系膜细胞增殖，最终导致间质的纤维化肾小球的肥大，加速了小的发生与发展。Ang为系膜细胞外基质合成的强诱导剂，主要是导致系膜细胞增殖肥大，促使ECM合成、沉积，最终促进叽的发展，发生肾脏纤维化(3)。故本研究采用高糖环境下，Ang诱导系膜细胞增殖。目前认为，DN为本虚标实之证，以脾肾及气血阴阳之虚为本，气滞、湿阻、血瘀、痰聚为标，气阴两虚是糖尿病肾病发病基础，消渴病曰久不愈，伤阴耗气。益气养阴、化瘀通络中药是陈志强教授针对临床上病程中气阴两虚，血瘀浊聚基本病机而确立的复方中药，其中黄茂益气，走而不守，配伍茯苓、砂仁、熟地，气阴兼顾、健脾益气、补肾敛精、利水消肿;水蛭性缓则气血不伤，善入则坚积易破，配伍地龙、鳖中，活血祛瘀，散结软坚;大黄同煎，可通腑泄热，荡涤积滞，使浊邪从下窍而出；与积雪草同用，有清热利湿、消肿解毒之