异体脱蛋白松质骨复合纤维蛋白BMP修复兔桡骨缺损(一)

1、异体脱蛋白松质骨复合纤维蛋白 BMP 修复兔桡骨缺损 (一) 【摘要】 探讨以纤维蛋白复合脱蛋白松质骨作为骨形态发生蛋白 (BMP) 的载体修复兔节段性骨缺损。 方法于 36 只青紫蓝兔两侧桡骨干处 造成1.5cm缺损，采用三种方法进行处理：A组，植入脱蛋白松质骨、 纤维蛋白、BMP的复合物；B组，植入脱蛋白松质骨；C组，空白对照。 术后 2、 4、 8、 12、 16 周进行放射学、组织学和电镜检查。 结果 A 组骨缺损区在成骨活泼程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著 优于B组，使骨缺损得到了较彻底的修复。B、C两组均不能产生骨性 愈合。结论脱蛋白松质骨复合纤维蛋白是较理想的BMP载体材

2、料，以三者的复合物修复骨缺损可到达满意效果。【关键词】脱蛋白松质骨纤维蛋白 BMP组织工程骨缺损修复 AbstractObjectiveTorepairsegmentalbonedefectwiththecompositeofdeproteinisedcancellous bone,bonemorphogeneticprotein(BMP)andfibrin. Method Bonedefectswerecreatedin36NewZealandrabbitsonthebilateralradiiandtre atedwiththreekindsofimplantations:A,compos

3、iteofdeproteinisedcancellous bone,BMPandfibrin;B,ofdeproteinisedcancellousbone;C,blankcontrol.Thed efectswereobservedbyentgenography,opticalmicroscopy,andelectron-micr oscopyat2,4,8,12,16weeks.ResultThedefectstreatedwithAimplantationregeneratedmuchmorenewboneandb ridgedearlierthanthedefectstreatedwi

4、thBimplantationandgotcompletelyrepaired16weeksafteroperation.ThedefectswithBandCimplantationcouldn' tgetosseoustissuehealing. Conclusion Thecompositeofdeproteinisedcancellousbone,bonemorphogeneticprotein( BMP)andfibrincanbeeffectivelyusedtorepairsegmentalbonedefect.Keywords ： deproteinisedcancel

5、lousbone;fibrin;bonemorphogeneticprotein(BMP);tiss ueengineering;bonedefect;repair 骨具有再生和修复能力，因肿瘤切除、外伤、骨异常生长所造成的骨 缺损，在单纯依靠骨自行修复无法愈合的情况下， 那么需采用手术治疗。 自体骨移植是一种较好的治疗方法，已被广泛应用于临床。但其来源 有限，不能满足临床需求，而且对患者造成创伤，于是人们把眼光转 向能促进组织或细胞生长、分化和增殖的材料。本实验就异体脱蛋白 松质骨复合纤维蛋白、 BMP 修复兔桡骨缺损的方法和机制进行探讨， 以评价复合材料作为骨组织工程材料的作用。1 材料和

6、方法1.1 植入材料的制备1.1.1 异体松质骨的制备取青紫蓝兔 (兰州生物制品研究所提供 )脊柱骨、 骨盆骨、长骨干骺端，剔除骨膜和软组织，去除其外表皮质骨，制成 直径约O.5cmx O.5cmx 0.5cr大小松质骨颗粒，用流动自来水反复冲洗 骨粒45h,致无血渍浸出为止，将其放入蒸馏水三角瓶中，摇床上震 动45h。其间每30min换蒸馏水一次，再将其放入超声波清洗机中反复进行清洗，每次30min，清洗35次，自然晾干后，将其放入甲醇 与氯仿(1 : 1)混合液中，不时搅拌，12h更换混合液，倒弃混合液，蒸 馏水冲洗骨粒3次，自然晾干。用0.6mol/LHCL脱钙5min，蒸馏水冲 洗3次

7、，自然晾干，转入30%过氧化氢中，不时搅拌，12h更换过氧化 氢液一次，处理24h,蒸馏水冲洗3次，自然晾干，转入-80 C深低温 冰箱冷冻保存。及纤维蛋白的提取按照 Urist 1报道的方法从小牛新鲜皮 质骨中提取，提取物置-4C保存。纤维蛋白原用冷沉淀法自同种异体兔 的血液中提取2。采集 1 5只健康成年青紫蓝兔的抗凝全血并于 3000r /min，离心10min,别离出血清，置-30C冰箱冻存过夜，次日转入4C 冰箱缓慢融解，待彻底融解后，于4C条件下离心，收集冷沉淀。冷沉 淀用冷冻枯燥机冻成干粉,再用重蒸水溶解,配成120mgml 的纤维蛋白原溶液。脱蛋白松质骨/ BMP复合物的制备将

8、深低温保存的异体脱蛋白松 质骨取出，冷冻枯燥机枯燥，装入培养皿中，1.0 x 106rads60CS照(兰 州辐照中心)，将100mg提取的小牛骨形态发生蛋白溶于10mL的 4mol/L 的盐酸胍溶液中，参加10g异体松质骨颗粒，4 C,充分搅拌混匀液体 与固体成分，置冷冻枯燥机内抽真空、透析、冻干24h,分装。脱蛋白松质骨/ BMP/纤维蛋白复合物的制备将处理好的异体脱 蛋白松质/BMP复合物置于圆柱形模板内，浸没于纤维蛋白原中，按 纤维蛋白胶的制备比例混入凝血酶,复合支架制备成功。1.2试验方法选用青紫蓝兔36只，体质量23kg不等，雌雄不限，随 机分为3组。在无菌手术室中，速眠新-H麻醉

9、满意后，常规去毛、消 毒、铺巾。取前臂纵行切口，长约 34cm,行双侧桡骨中段截骨，造 成 15mm 的骨和骨膜缺损，分别按组植入材料。具体分组见下表。创 口缝合,肢体不做固定。将其分笼饲养,自由活动。术后肌注庆大霉 素预防感染。分别于术后 4、 8、 12、 16 周取材,每次 3 只。表 1 试验 分组情况表左侧右侧数量A脱蛋白松质骨/rhBMP/纤维蛋白复合物脱蛋 白松质骨 /rhBMP/1.3观察指标1.3, 1X 线检查各组动物于手术当日和取材日拍双侧尺、 桡骨正侧位片, 观察各组内及组间术后不同时间的骨缺损愈合情况。组织学观察取材标本用 10%甲醛溶液固定,常规脱钙、脱水、石 蜡包

10、埋、连续切片,行 HE 染色,光镜下观察骨缺损愈合情况。扫描电镜观察术后16周取A组标本，生理盐水漂洗，2.5%戊二醛 固定，O.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次后用1%锇酸固定2h, 50%、70%、 80%、90%、95%丙酮梯级脱水各15min,醋酸异戊酯15min浸泡，干 燥,镀膜,电镜观察。大体标本各组动物于取材当日拍摄大体标本,观察其大体愈合情 况。2 结果2.1X线检查A 组术后 4 周骨缺损两端有少量密度较低的骨痂形成， 缺损区呈大片云 雾状影，密度低于骨干；术后 8 周新骨桥接骨缺损，密度均匀，形成 连续性骨痂；术后 12周骨皮质已完整形成， 髓腔未完全形成； 术后 16 周骨性连接形成，髓腔再通。B组术后4周缺损区大片云雾状影，密度低于骨干，两断端有骨痂形成； 术后 8 周缺损区