原位杂交操作流程

1、原位杂交操作流程原位杂交操作流程冰冻切片的（冰冻切片的（DIG-labeled RNA probe）原位杂交操作程序）原位杂交操作程序一、一、 切片制备切片制备用新鲜组织制作用新鲜组织制作6m厚冰冻切片，厚冰冻切片，37干燥干燥14小时，进行下一步操作。小时，进行下一步操作。二、二、 预杂交前处理预杂交前处理预固定预固定：4%PFA（in DEPC-PBS Ph7.4）RT 3060min 4%PFA：多聚甲醛多聚甲醛 20g 1PBS 450ml 加热（加热（60、20min）溶解）溶解 冷却后调冷却后调pH至至7.4 1PBS 500mlPBS RT 5 min2 10PBS：500ml

2、NaCl 40g KCl 1g KH2PO4 1g Na2HPO4 7.7g DEPC水水 450ml 调调Ph至至7.5 DEPC水加至水加至500mlPBS(含含0.3%v/vTritonX-100) RT 15 min 临用前配制临用前配制 10%TritonX-100 15ml 1PBS 500ml PBS RT 5min 2消化消化： 2g/mlProteinase K in TE buffer 37 10 min TE： pH8.0 Tris-HCl 1M 5ml pH8.0 EDTA 0.5M 1ml DEPC水水 500ml 0.2%Glycin in PBS RT 5 min

3、2 (50 xDenharts; Ficoll 400 聚蔗糖聚蔗糖 1g 后固定后固定：4%PFA in PBS RT 15 min PVP 聚乙烯基吡咯烷酮聚乙烯基吡咯烷酮 1g BSA 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 1g DEPC 水水 100ml） PBS RT 3 min2 0.1 M 三乙醇胺（三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐乙酸酐 RT 5 min2 0.1M 三乙醇胺三乙醇胺：三乙醇胺：三乙醇胺 2.64ml DEPC水水 200ml 用前加入乙酸酐用前加入乙酸酐 500lPBS RT 5 min2三、三、 预杂交预杂交 预杂交预杂交 50 2h 预杂交液：预杂交液： 50%去

4、离子甲酰胺去离子甲酰胺 5SSC 5Denhardts 0.02%SDS 0.1mg/mltRNA四、四、 杂交杂交杂交杂交 50 12h以上以上 五、五、 杂交后处理杂交后处理2SSC脱去盖膜（片）脱去盖膜（片） 502SSC清洗清洗 37 10 min2 20g/mlRNaseA in Rnsae buffer 37 30 min Rnsae buffer;2M Tris 5ml 0.25MEDTA 4ml 3MnaCl 167ml pH8.0 D W 1000ml Rnase buffer 37 30 min 2SSC 50 15 min2 1SSC（含（含0.02%SDS）37 15

5、min2 5%SDS 2ml 1SSC 500ml 0.1SSC 37 15 min2 Buffer 37 10 min2 Buffer: 2M Tris-HCl Ph7.6 25ml 3M NaCl 25ml D.W. 500ml封闭；封闭；0.5%抗体阻断液抗体阻断液 in Buffer（含（含0.2%Tween20） 37 20 min 抗体阻断液抗体阻断液 : (1:500抗地高辛抗体抗地高辛抗体 in 阻断液阻断液 37 2 h) 阻断剂阻断剂 1g Tween-20 0.4ml Buffer 37 10 min2 Buffer 200ml Buffer 37 10 min2 显色；

6、显色； Buffer: 2M Tris 10ml（1:50NBT/BCIP Stock Solution in Buffer 224h） 3M NaCl 6.67ml MgCl2 2.033g（湿合、避光）（湿合、避光） D.W. 180ml 浓浓HCl调调pH至至9.5 D.W. 200ml终止反应：终止反应： Buffer RT 5min2 流水冲洗流水冲洗 5-10min 1%甲基绿复染甲基绿复染3-10min， 水洗，晾干，封固水洗，晾干，封固DNA探针检测石蜡切片中DNA组织标本 肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58烤18h。试剂试剂1

7、12020SSCSSC2 2HBV cDNA-DigHBV cDNA-Dig探针探针 5 5 g g3 34 4多聚甲醛多聚甲醛4 40.1mol/L PBS0.1mol/L PBS，pH7.4pH7.45 50.2mmol/L HCl 0.2mmol/L HCl 和和0.1mol/L0.1mol/L甘氨酸甘氨酸 PBS pH7.4PBS pH7.46 60.4 0.4 Tritor X-100 PBS pH7.4Tritor X-100 PBS pH7.47 7蛋白酶蛋白酶 20 20 g/mlg/ml8 80.250.25乙酸酐，用乙酸酐，用0.1mol/L0.1mol/L三乙醇胺配制三乙

8、醇胺配制9 9预杂交缓冲液和杂交缓冲液预杂交缓冲液和杂交缓冲液10. AKP10. AKP标记抗标记抗Dig FabDig Fab段二抗，可段二抗，可1:5001:500稀释稀释11. TSM11. TSM、TSM2TSM2（配制参阅附录（配制参阅附录4 4）12. NBT12. NBT和和BCIPBCIP显色液或用显色液或用AKPAKP显色显色KitKit 操作流程 杂交前处理 预杂交 杂交 杂交后漂洗 杂交后检测 结果判断杂交前处理1. 石蜡切片常规脱蜡至水2. 0.02M pH7.4 PBS洗33min3. 0.2M HCI 20min 室温 （除去蛋白）4. 2SSC（内含5M EDT

9、A） 50 洗 30min5. 蛋白酶 2g/ml 37 20min6. 0.1M甘氨酸PBS洗 10min 室温，中止酶反应7. 4多聚甲醛，20min 室温8. PBS洗 33min9. 75，85，95和无水乙醇各2min预杂交和杂交 加预杂交液 20l/每片，42 2h。 加杂交液1020ul/每片（内含HBV-cDNA Dig标记探针4g/ml），加盖硅化玻片，将切片置于95 10min，使探针和靶病毒DNA双链打开（变性），然后迅速置于冰上5min，再将切片置于盛有2SSC湿合内，42杂交过夜(1216h)。杂交后漂洗杂交后漂洗1. 将切片置于2SSC液内振动移去盖片2. 2SSC

10、洗 210min， 553. 0.5SSC 25min， 504. PBS洗33min5. 10醋酸 20min 室温，阻断内源性碱性磷酸酶6. PBS洗33min信号放大和显示信号放大和显示1. 1:500稀释AKP标记抗Dig二抗，37 4h，或4过夜2. PBS洗 33min3. TSM1洗 25min4. TSM2洗 25min5.显色液 在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l， BCIP 混合后，显色30min12h，中间不断观察6. TSM2洗，PBS洗33min，核固红或甲基绿衬染7. 蒸镏水洗，系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片结果判断结果判断ISHISH流程流程 探针

11、合成探针合成 组织细胞标本的准备组织细胞标本的准备 ISHISH试剂的配制试剂的配制 操作流程操作流程探探 针针 1、根据文献报道合成PCR引物一对。 2、PCR扩增：用高保真DNA聚合酶 进行PCR扩增。 3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACC I酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19 MCS侧面的SP6和T7 RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lac Z -肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7 RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可

12、允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。 4、 利用Roche生产的体外转录标记RNA kit（Cat.No 999644）操作流程参阅原位检测技术p132-133。 组织细胞标本的准备组织细胞标本的准备 ISHISH试剂的配制（所有试剂和用具试剂的配制（所有试剂和用具均用均用DEPCDEPC水处理）水处理）操作流程操作流程1 1、活细胞经4多聚甲醛固定20min，室温，PBS洗，系列乙醇脱水。2、组织标本：标准取材后，4多聚甲醛固定6h，用25遮糖或液氮速冻，切片贴在涂有APES胶的干净载玻片上。3、PBS洗33min，冰冻切用4%柠檬酸盐90保温20min，石蜡切片98

13、10min，细胞片不用。4、2g/ml蛋白酶K 37 20min，PBS洗33min。5、0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.6、0.25%乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)洗10min，PBS洗10min。7 7、预杂交、预杂交 0.20.2SSCSSC5050甲酰胺甲酰胺 30min 3730min 37。8 8、杂交：滴加杂交液（、杂交：滴加杂交液（2g/ml2g/ml） 加一层复盖膜，加一层复盖膜，4848杂交杂交8-12h8-12h。9 9、杂交后洗：、杂交后洗： 2 2SSCSSC洗洗 2 25min 455min 45 1 1SSCSSC洗洗 2 25min 5min 室温室温 0.50.5SSCSSC洗洗 2 25min 5min