动脉粥样硬化大血管和微血管病变的干预靶点研究

1、动脉粥样硬化大血管和微血管病变的干预靶点研究1 研究背景动脉粥样硬化 (Atherosclerosis, AS) 不仅可以累及体循环的大中动脉也可累及前小动脉和小动脉导致微血管病变, 这些血管病变可引起多个器官的形态和功能异常，其中，心、脑、肾是主要的AS靶器官，可导致心肌梗死、缺 血性心肌病, 脑卒中和慢性肾病, 最终导致多器官功能衰竭和死亡。因此, 深入研究AS大血管和微血管病变的发生机制和干预靶点，对于AS的防治具有重要的理 论和实际意义。九十年代以来大量研究显示，AS易损斑块的形成是急性心脑血管事件的主要原因, 因此 , 斑块易损性也成为国内外研究的热点 , 其主要的病理学特点包括较薄

2、的纤维帽 , 较大的脂质核心和大量炎性细胞浸润。由于胶原是纤维帽的主要构成成分, 因此斑块内胶原代谢紊乱是影响斑块易损性的重要因素。4-羟基-脯氨酸羟化酶(P4H)是所有已知类型的胶原合成过程中的关键酶,能 够催化位于X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)重复序列中的脯氨酸变为羟脯氨酸, 该反应在前胶原多肽链折叠成稳定的三螺旋结构的过程中发挥重要作用。P4H的同工酶P4Ha1在多种组织中均有表达，其表达减少可导致斑块内胶原含量减少， 进而导致AS斑块不稳定，因而是决定斑块稳定性的重要因素。既往研究发现多种因素均能影响 P4Ha1的表达，例如TGF0 1能够上调P4Ha1 的表达而吸烟可抑制其

3、表达；本实验室也曾发现炎症因子 TNF-a和IL-6分别通 过ASK1-JNK-NonG口 ERK1/2-Sp1信号通路抑制P4Ha1的表达。氧化型低密度脂 蛋白 (oxidized low density lipoprotein, ox-LDL) 是动脉粥样硬化形成和发展过程中的重要危险因素。研究发现 ox-LDL 能够激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)增加胶原降解,进而诱导斑块不稳定。但是，ox-LDL能否通过调节P4Ha 1的表达进而调节胶原合成目前尚未见报道。他汀类药物不仅具有降脂作用 , 还具有多种有益于心血管疾病的作用。大量研究证实他

4、汀类药物能够增加斑块内胶原含量进而增加斑块稳定性, 其机制为他汀类药物抑制MMPS勺表达和活性以及增加了基质金属蛋白酶组织抑制因子 -1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1) 的表达。然而,他汀类药物能否通过调节P4Ha 1的表达进而调节胶原合成目前尚未 见报道。2研究目的(1)探讨ox-LDL对P4Ha 1的抑制作用及其机制并探讨辛伐 他汀的干预作用；(2)观察辛伐他汀干预对斑块内P4Ha 1表达的影响及并探讨其 机制 , 揭示他汀类药物稳定动脉粥样硬化斑块的新靶点。1.1 实验方法 3.1 细胞培养与处理(1) 在时间 -效应实验

5、中 , 我们用 50ug/ml 的ox-LDL刺激平滑肌细胞0、4、8、12和24小时，为保证ox-LDL不至于因为刺激 时间过长而降解或者失活，每隔8小时更换含有50仙g/ml的ox-LDL的新鲜培养 基；在剂量-效应实验中，0、25、50ug/ml的ox-LDL分别刺激平滑肌细胞8小时, 收集细胞。(2)50ug/ml的ox-LDL或者50ug/ml的ox-LDL+辛伐他汀分别刺激细 胞0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时，检测MAPK勺激 活。我们应用MAPK勺抑制齐1J以及MAPK勺小分子干扰RNA#理细胞，然后应用 50ug/ml 的 ox-LDL 刺激细胞 8

6、 小时 , 收集细胞。 (3) 在正常培养基或者ox-LDL 刺激条件下 , 辛伐他汀干预细胞进行相关检测。1.2 动物模型的建立120只 8周龄雄性 ApoE-/- 小鼠随机分为两组普通饮食组 (n=40) 和高脂饮食组(n=80) 。 2 周后 , 所有小鼠均给予右侧颈总动脉套管以 促进AS斑块形成。套管术后6周，普通饮食组随机分为两组（每组20只）Mockl组 （0.5%methylcellulose单独灌胃）和Sim1组（辛伐他汀溶于0.5%甲基纤维素,50mg/kgd量灌胃）；高脂饮食组随机分为四组（每组20只）Mock2组（0.5% 甲基纤维素单独灌胃）,SB组（p38MAPK卬制

7、齐1J SB203580,2mg/kgd腹腔注射）,PD 组（ERK1/2抑制剂PD98059,2mg/kgd腹腔注射）,Sim2组（辛伐他汀溶于0.5%甲 基纤维素，50mg/kg d量灌胃）。治疗6周后对小鼠称重行安乐死。1.3 RT-PCR收集细胞，提取 mRNAt测 P4Ha 1mRNAK平。3.4Western blot 收集细胞和颈动脉斑块组织，提取蛋白，检测P4Hx 1、I型胶原和m型胶原、 P-/T-p38MAPK、 P-/T-JNK、 P-/T-ERK1/2 的表达。3.5 ELISA收集细胞上清，ELISA试剂盒检测上清液中I型和田型胶原含量。3.6 Dil-ox-LDL

8、摄取实验 DiI-ox-LDL 刺激细胞 8小时 ,激光共聚焦照相观察细胞 摄取情况。3.7 血脂检测动物试验结束前, 收集小鼠空腹血清, 检测总胆固醇 （TC） 、 甘油三脂 （TG） 、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C） 和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C） 的水平。3.8 H&E、油红 O 天狼猩红染色以及 MOMA-2 a -SM actin和ox-LDL的免疫组 化染色制备颈动脉斑块冰冻组织切片，行H&Efe色观察大体形态，油红球色检测 脂质含量，天狼猩红染色检测胶原含量，MOMA-2ffi a-SM actin染色分别检测巨噬 细胞和平滑肌细胞含量, 计算易损指数。免疫

9、组化染色检测斑块内 ox-LDL 的含量。 4结果 4.1 细胞实验 4.1.1ox-LDL 对P4Ha l的抑制作用在时间-效应实验中，50ug/ml的ox-LDL能够抑制P4Ha 1, 在 8 小时时间点达到最大抑制效应；在剂量- 效应实验中 , 随着 ox-LDL 浓度升高，P4Ha1的mRNA口蛋白水平呈递减趋势,在50ug/ml达到最大抑制效应我们也应用 Western blot和ELISA检测了 ox-LDL刺激细胞8小时后胶原的 含量，结果显示ox-LDL显著抑制I型和m型胶原的表达和分泌。 4.1.2ox-LDL通 过激活p38MAp和ERK1/2信号通路发挥抑制作用Ox-LD

10、L®J激平滑肌细胞0分钟、 5分钟、15分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时，检测MAP瞰活。结果发现p38MAPK口 ERK1/2磷酸化水平在5分钟达高峰，之后虽然逐渐减弱， 但在 8 小时仍显著高于0 分钟时 , 说明 ox-LDL 对其激活可持续至8 小时。但是,ox-LDL对JNK的磷酸化水平无明显影响。应用p38MApKJNK口 ERK1/2的抑制剂或者siRNA处理细胞，然后应用ox-LDL 刺激细胞检测P4Hal的表达，发现抑制或基因沉默p38MAp翱ERKl/2后ox-LDL 对P4Ha 1的抑制作用明显减弱，而JNK的阻断或者基因沉默对P4Ha 1的表达无 显著影

11、响。4.1.3辛伐他汀逆转ox-LDL对P4Ha 1的抑制作用辛伐他汀不能改变 正常情况下平滑肌细胞P4Ha 1的表达水平，但是可以显著逆转ox-LDL刺激细胞 对P4Ha1的抑制效应，相应的增加了胶原的合成。探讨其机制发现辛伐他汀能够减少细胞对 ox-LDL的摄取，抑制p38MAp翱 ERK1/2的磷酸化。4.2动物实验4.2.1动物体重及血脂水平各组 ApoE-/-小鼠的 体重无显著差异。高脂饮食小鼠TG TG LDL-C较普通饮食小鼠显著升高而 HDL-C显著降低； 高脂饮食组内的四个亚组间各血脂指标无显著差异。 4.2.2 辛伐他汀、 SB203580 和PD98059t曾加AS斑块稳

12、定性普通饮食组内，辛伐他汀干预未显著改变斑块的易 损指数。与Mockl组相比,Mock2组AS斑块的易损指数显著升高，提示动脉粥样硬化易损斑块造模成功。在高脂饮食组内,辛伐他汀、SB203580和PD98059T预能够 显著降低斑块的易损指数。4.2.3辛伐他汀上调不稳定斑块内 P4Ha1与Mockl相比,Mock2组P4Ha1的表 达水平显著降低，提示不稳定斑块内P4Ha1生成减少。在普通饮食组内，辛伐他汀 干预未明显改变P4Ha1的表达。但是，在高脂饮食组内，辛伐他汀、SB20358酥口 PD98059FF预显著增加斑块 内P4Ha 1的表达水平。与Mock2组相比，辛伐他汀治疗还能够降低

13、斑块内 ox-LDL 的含量，抑制p38MAp网ERKl/2的磷酸化。5结论ox-LDL通过激活p38MAPKK ERK1/2信号通路抑制P4Ha1和胶原 的合成。(2)他汀类药物能够逆转ox-LDL对P4Ha 1的抑制作用，具机制是他汀类 药物减少了细胞对ox-LDL的摄取，抑制p38MAPK0 ERKl/2的激活。(3)在ApoE-/-小鼠模型中，他汀类药物可增加AS斑块内P4Ha 1的表达和胶 原合成 , 达到稳定斑块的作用。本研究揭示了他汀类药物稳定斑块的新的干预靶 点 , 具有重要的学术意义。1 研究背景急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS) 是引

14、起急性心脑血管事件的主要原因。目前已证实动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 易损 斑块破裂是ACS发病的始动环节。研究发现易损斑块具有以下特点： 较大的脂核、 较薄的纤维帽、 多种炎症细胞聚集以及斑块内胶原合成降解失衡。其中 , 胶原代谢是影响斑块稳定性的重要 原因。4羟基-脯氨酸羟化酶(P4H)是所有己知的21种胶原合成过程中的关键酶，能 够催化X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)重复序列中的脯氨酸变为羟基脯氨酸，从而促进前胶原多肽链折叠成稳定的三螺旋结构。作为P4H的同工酶,P4H a 1是胶原合成过程中的重要限速酶。抑制P4Ha t1的表达可减少AS斑块内胶原合

15、成，进而导致易损斑块形成；与 之相反,过表达P4Ha 1则会促进胶原的合成。既往研究发现TGF0 1能够促进P4H a 1的表达而吸烟可抑制其表达。近年来 , 本实验室张澄等研究发现在人类主动脉平滑肌细胞中 ,TNF-a 具有抑制P4Ha1表达的作用，并提出了完整的信号转导通路即 ASK1-MKK4-JNK1-NonO, 首次提出NonQt P4Hal合成的重要转录因子，在调节胶原合成过程中发挥重要作 用，但是目前尚缺乏动物实验验证。NonO即人类的p54nrb蛋白）是一个大小为 54KDM在体内广泛表达的蛋白，是一个无PO阴构域的八聚体结合蛋白,NonO 含有两个核酸结合域，可直接与DNAg

16、合参与转录调控；另外，NonO也可与其他 转录蛋白相互作用调节基因表达。如前所述，本实验室研究发现NonO是P4Hal合成的重要转录因子，在调节胶 原合成过程中发挥重要作用。既往研究还发现NonC参与调节环磷酸腺甘（cyclic adenosine monophosphate, cAMP猜号通路，而该信号通路可参与炎症反应，促进 TNF-a、IL-2、IL-6等炎症因子的表达；另外，NonO能够参与COX-23 -UTR的 多聚腺甘酸化，影响其转录，而COX-2亦参与了炎症反应和AS的进展。上述研究提示NonO可能参与调节胶原代谢和炎症反应。综合国内外研究现 状,NonO在AS中的作用研究尚未

17、明确。对于大多数急性心血管事件来说 , 易损斑块的稳定性是影响事件的决定性因素，但目前,NonO是否影响易损斑块的稳定性尚无报道。2研究目的（1）体内实验 中，通过过表达和基因沉默 NonO观察NonO对易损斑块破裂率的影响以及斑块内成分的改变。(2)体外实验中,通过过表达和基因沉默NonOR讨NonO1定斑块的分子机制。3方法3.1NonO干扰及过表达慢病毒载体的构建构建三个干扰(si-A、si-B、si-C)和一个过表达NonO勺慢病毒载体，以携带乱序siRNA的慢病毒载体作为干扰对照， 以只携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体作为过表达对照。转染RAW264.却胞筛选最佳的干扰序列以及验证携

18、带NonOS因的慢病毒的过表达效果。 3.2 动物模型的建立(1)20 只 8 周龄雄性 ApoE-/- 小鼠高脂喂养2周后，随机分为两组：Control组(Il=10):无颈动脉套管及精神应激；Mock组忙=10) ：行颈动脉套管手术, 手术 8周后行精神应激, 具体方法如下：将ApoE-/- 小鼠置于容积为50ml、带有通气孔的塑料针管中，同时进行噪音刺激。噪音刺激强度为110dB，每5分钟一次，每次持续3秒。每天持续6小时，共 应激四周。实验第 14 周末 ,ApoE-/- 小鼠被处以安乐死。 (2) 为观察慢病毒转染效率及时间变化 ,15 只 ApoE-/- 小鼠行颈动脉套管手术后八周

19、 ,颈动脉局部转染携带 GFP基因的慢病毒，并分别于转染前(n=5)、转染pGC-GFP-LW 2周(n=)和转染pGC-GFP-LW 4周(n=5)进行取材，观察各个时间点慢病毒转染效率。(3)8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养2周后，右侧颈总动脉套管诱导AS斑块形成。 颈总动脉套管手术8 周后 , 根据转染病毒的不同 , 将 ApoE-/- 小鼠随机分为5组：(1) Control组(不加干预)；(2) si-N.C 组(转染携带乱序siRNA的慢病毒、 ； (3) si-NonO 组(转染携带 si-NonO 的慢病毒 ) ； (4)N.C 组 (转染只携带GFP的慢病毒)；(5)No

20、nO组(转染携带NonC®因的慢病毒)。转染后第 3 天开始应激刺激 , 刺激方法同前。 实验第 14 周末 ,ApoE-/- 小鼠被处以安乐死。3.3 体重及血脂的检测实验开始前和 14周末对所有ApoE-/- 小鼠行体重测量,每只小鼠测量3 次后取其平均值。实验14 周末穿刺左心室采血, 常温静置 30 分钟以后置于离心机中 3000 转离心 15 分钟 , 取上层血清, 酶法检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C） 的浓度。3.4 组织病理学的检测制备右侧颈总动脉切片 , 对颈总动脉斑块进行H&E、

21、油红。和天狼猩红染色并应用免疫组织化学染色的方法检测颈总动脉斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞、IL-1屋IL-6、MMP-2ffi MMP-勺含量，计算易损指数。3.5 细胞培养（1）在时间梯度实验中，RAW264.7细胞应用100ng/ml的TNF-a分别刺激 0、6、12、24和48h;在剂量梯度实验中，我们应用0、25、50和100ng/ml的 TNF-a 刺激 RAW264尾田月fi 24h。收集细胞提取蛋白检测NonO表达水平。（2）根据转染病毒的不同，将细胞分 为5组：Control组：不加任何干预；si-N.C组：转染携带乱序siRNA的慢 病毒；si-NonO组：转染携带si-Non

22、O的慢病毒；N.C组：转染只携带GFP 的慢病毒；NonCffl:转染携带NonO®因的慢病毒。100ng/ml的TNF-a痢J激24小时，收集细胞。3.6实时定量PCR攵集右侧颈 总动脉组织，提取mRN颇测颈动脉斑块内 NonO MMP-2B MMP-勺mRNAK平。3.7 Western blot 收集右侧颈总动脉斑块组织和细胞 , 提取蛋白 , 检测颈动脉斑块内 NonO. MMP-2 MMP-9 P4Ha 1、LOX-1、COX-2以及平滑肌细胞内 NonO MMP-2.MMP-9 IL-1 0、MCP-1 ICAM-1、VCAM-1 p/t-NF- k B p65 以及 I

23、 k Ba 的蛋白表达水平。 3.8 细胞免疫荧光化学细胞免疫荧光化学法检测五组RAW264.7 细胞内NF- k B的核转位情况。3.9 免疫共沉淀收集细胞蛋白,检测TNF-a制J激RAW264.却胞后NonOW NF- kB的结合情况。4结果4.1AS斑块内以及TNF-a刺激的RAW264.衲NonO的表 达水平在体内实验中 , 与 Control 组正常的颈动脉相比 ,Mock 组小鼠颈动脉斑块内NonO mRNA蛋白表达显著升高，提示NonO在斑块进展中可能发挥作用。在体外实验中，时间梯度实验显示100ng/ml TNF- a能上调NonO勺表达，在 24小时达到最大效应；浓度梯度实验

24、显示10ng/ml TNF-a痢J激24小时便能显著 提高NonO的表达，在100ng/ml时达最大效应。4.2RAW264.7细胞中慢病毒干扰 及过表达NonO的效率和效果将 N.C、si-A、si-B、si-C 及NonO-LV分别转染小 鼠RAW264%田胞，转染4天后观察慢病毒携带的报告基因 GFP的表达情况，发现 感染效率均大于70%进而收集细胞提取蛋白质进行检测。结果表明，si-A > si-B > si-C转染致NonCg白表达分别减少 57% 43%口 44%, 进而筛选出最有效的干扰位点 si-A 用于随后动物和细胞实验中 si-NonO 组的转 染；而NonO-

25、LV专染细胞能够使NonCg白水平较Control组增加70%用于随后 动物和细胞实验中NonO组的转染。4.3慢病毒在颈动脉斑块的转染效率在颈动 脉斑块局部转染慢病毒开始前、2周末和4周末取材，发现转染两周后GFP显著 表达，然后开始衰减,4周末斑块内仍可见GFPS达，但是较2周前已有减弱。4.4 颈动脉斑块内NonCFF扰及过表达效果留取颈动脉斑块组织，检测斑块内 NonO勺mRNA口蛋白表达水平。结果显示,si-NonO 组NonO的mRNAF口蛋白水平 较Control组分别下降了 47%口 43%,而NonCffl则分别增长了 61%口 59%,但在 si-N.C组和N.C组中Non

26、O勺mRNA口蛋白水平与Control组相比无显著差异。4.5 实验动物一般情况实验各组ApoE-/- 小鼠均顺利完成实验, 慢病毒转染小鼠中未观察到明显的局部和全身性的不良反应。 各组 ApoE-/- 小鼠的体重无显 著性差异，血清中TG TG、LDL-C和HDL-C的浓度亦无发现显著统计学差异。4.6NonO对AS斑块破裂率的影响通过对连续组织病理切片的H&Efe色分析,我们发现 Control 组、si-N.C 组和 N.C组各有 46.67%(7/15),si-NonO 组有 13.33%(2/15),NonO组有66.67%(10/15)的AS斑块发生破裂。统计分析显 示,s

27、i-NonO组斑块破裂率显著低于Control组，而NonCffl斑块破裂率则显著高 于Control组;Control组、si-N.C组和N.C组三组间斑块破裂率无统计学差异。含铁血黄素染色进一步验证了斑块破裂。4.7NonO对AS斑块成分及其易损 性的影响与Control 组相比 ,si-NonO 组的斑块内巨噬细胞含量、脂质含量和易损指数显著降低，而平滑肌细胞含量和胶原含量显著升高；NonCffl结果与 si-NonO 组相反。Control组、si-N.C 组和N.C组问上述指标无显著差异。4.8NonO对P4Ha 1 表达的影响体内实验显示 Control组、si-N.C组和N.C组

28、三组间颈动脉斑块内 P4Ha 1的蛋白表达无显著差异。与Control组相比,si-NonO组颈动脉斑块内P4Hx 1的蛋白水平显著增高， 而NonCffl则显著降低，说明Non集与才制P4Ha 1的表达。4.9NonO对基质金属 蛋白酶表达的影响在体内实验中,si-NonO组颈动脉斑块内MMP-去口 MMP-9勺 mRNA平显著低于 Control组；免疫组化和 western blot检测也证明MMP-2F口 MMP-9g白水平在 si-NonO 组显著降低，而 NonOl& MMP-2F口 MMP-9mRNAS白水 平较 Contro 组显著升高。Control组、si-N.C组

29、和N.C组三组间MMP-2F口 MMP-9g达水平无显著差异。 体外 Western blot 结果与该结果一致。同时，我们也检测了 RAW2642田胞刺激后MMP-2F口 MMP-9舌性的改变,结果发现与Control组相比,si-NonO组MMP-去口 MMP-9舌性均显著降低，而NonCfi 则显著升高。4.10NonO对炎症因子的影响在体内实验中，免疫组化分析显示 si-NonO组的炎症因子IL-1 0和IL-6的蛋白水平较Control组显著降低，而NonO组则显著增加 IL-1p 和 IL-6 的蛋白表达； western blot 结果显示 si-NonO 组的 LOX-1和CO

30、X-2的蛋白表达显著低于 Control组，而NonO组LOX-1和COX-2的蛋白表达则显著升高。在体外实验中 ,Western blot 结果显示与Control 组相比 ,si-NonO 组 IL-10、MCP-1 ICAM-1和VCAM-廿匀显著降低，而NonCffl则显著升高。4.11NonO与NF- k B的相互作用免疫共沉淀检测发现 TNF-a能够增加Non0tt NF- k B的结合。细胞免疫荧光染色显示与 Control组相比,si-NonO组NF-k B的核转位显著 降低，而NonO组NF- k B的核转位显著增强。Western blot检测显示si-NonO组 的NF-

31、 k B磷酸化水平较Control组显著降低，而NonC组显著升高；I k Ba的变 化趋势与NF-k B磷酸化水平的变化趋势相反。5结论首次发现NonOt动脉粥样硬化硬化斑块中高表达。(2)在ApoE-/- 小鼠易损斑块模型中，NonO降低斑块稳定性，增加斑块的破裂率，而NonC®因沉 默后斑块稳定性增强 , 破裂率降低。(3) NonO降低斑块稳定性的机制为增加 MMP-加MMP-9勺生成，减少P4Ha1 的表达以及抑制NF- k B介导的局部炎症反应。1研究背景动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 是一组易感基因和危险因素共同作用导致的血管疾病。糖尿病(di

32、betes mellitus, DM) 是AS最重要的危险因素之一。鉴于 DM在AS中的重要作用,DM己作为冠状动脉粥样硬化性心脏病的等危症。DM引起心肌梗死和脑卒中等大血管疾病，也可引起慢性肾病即糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)?口神经病变等微血管疾病。多项大规模的临床试验结果表明 , 积极控制糖尿病患者的血糖水平有助于减轻微血管病变, 但无助于改善大血管病变, 提示两种血管病变的发生机制可能不同。因此 , 进一步探讨糖尿病微血管病变的发生机制和干预靶点具有重要的临床意义。由于DN是公认的糖尿病微血管病变，因此本文选择DN作为研究对象。研究发现肾素-血管紧张素系

33、统(Renin-angiotensin system, RAS) 在DN的 发病过程中起了关键作用，应用ACEI/ARB可有效的缓解糖尿病的肾脏损伤，但是 并不能达到预期效果，因此，寻找RAS系统新的干预靶点以有效缓解 DN成为亟待 解决的问题。ACE21 ACE勺同源物，本实验室研究发现ACE级其产物Ang(1-7) 能有效阻止AS 的发生发展；由于糖尿病是冠心病等危症, 我们因此又应用外源性ACE狂预糖尿病大鼠模型，发现ACE也显著改善了 DMb脏功能并减轻了糖尿病 肾脏损伤。目前已有大量的证据证实 ACE雄够延缓DN的发展，然而，作为ACE2的主要 产物,Ang(1-7)在DN中的独立作

34、用仍不明确。因此，深入研究其在DN中的作用对 于认识DN的发病机制以及DN的治疗具有重要意义。Ang(1-7)是一种7肽，是RAS系统中一种重要产物。在肾脏组织内，Ang(1-7) 主要由ACE冰解AngII生成，在维持肾脏内环境稳定中发挥重要作用。AngII可通过多种机制促进DN勺发展，包括升高全身血压以及肾内血流灌注 压，通过激活TGF-B、VEGF内皮素等促进细胞外基质的合成以及刺激氧化应激 等等。 而 Ang(1-7) 是一种舒血管肽, 可以对抗 AngII 的有害作用； 同时 Ang(1-7)可以减轻NADPK化酶(NADPHOxidase, NOX介导的氧化应激从而减轻蛋白尿并 改

35、善血管功能；另外，研究发现Ang(1-7)还能够抑制TGF-p的生成。Ang(1-7)的上述效应可能会延缓DN的发展。近期研究还发现给予糖尿病小 鼠重组人类ACE2tg够通过减少NOX舌性和PKCx、PKCg 1的生成减轻DN的进展, 这种保护作用可能是由 AngII 水平减低和 Ang(1-7) 生成增加介导的。研究发现外源性的Ang(1-7)的应用能够明显减轻STZ诱导的糖尿病大鼠的 蛋白尿、肾内胶原成分并能改善内皮功能，其原因可能是Mas受体的激活。然 而,Shao Y等却发现了与其上完全相反的一个现象：Ang(1-7)明显加重STZ诱导的糖尿病大鼠的肾功损伤。如前所述，目前关于外源性A

36、ng(1-7)对DM乍用的研究并不多，而且以上研究 还存在以下几个重要问题亟待解决：1、目前,Ang(1-7)对于DN的确切作用是有 益还是有害仍存有争议；2、不同剂量的Ang(1-7)对DN的具体作用尚未见报道； 3、Ang(1-7)与ARE®合治疗是否优于单一治疗目前仍不清楚。2研究目的(1)通过STZ注射构建DN的大鼠模型，观察Ang(1-7)对DN的作用，同时探讨Ang(1-7) 与ARE®合应用对DN的治疗效果。(2)体外实验中探讨Ang(1-7)对DN乍用的具体机制，为抗DN台疗提供新的 思路和药物作用的新靶点。 3 方法 3.1 动物模型 120只 10周龄的

37、雄性Wistar 大鼠随机分为两组：Control组(n=15,腹腔注射生理盐水)和DM且(n=105,腹腔注 射 STZ溶液,65mg/kg)。STZ注射48小时后，检测DMfi大鼠尾静脉血糖水平I6.7mmol/l为造模成 功。DMfc鼠每3天腹腔注射一次胰岛素(2-3U)维持血糖在16.7-25mmol/l以防 止高糖诱导的死亡。12周后,DM大鼠随机分为以下7组(每组15只)：NT组：不接受任何药物F预；S-Ang(1-7)组：200ng/kg-min 的 Ang(1-7) ; M-Ang(1-7)组：400ng/kg min的 Ang(1-7); L-Ang(1-7) 组： 800n

38、g/kg-min 的 Ang(1-7) ； Valsartan 组： 30mg/kg d 的缴沙坦,灌胃给药；L+V组：800ng/kg-min 的 Ang(1-7)+30mg/kg-d 的缴沙坦；L+A779®: 800ng/kg min 的 Ang(1-7)+800ng/kg-min 的 A770 Ang(1-7) 和A779均采用植入式胶囊渗透压泵皮下包埋持续泵入的给药方式。药物干预前收集大鼠尿液并颈静脉穿刺收集空腹静脉血。药物干预4 周 , 收集大鼠 24 小时尿液及空腹血液。3.2 大鼠一般情况检测实验结束后，测量各组大鼠的血糖、收缩压(SBP)、体 重、肾重、 24 小时

39、尿量、血液和尿液中肌酐含量并计算肌酐清除率。3.3 ELISAELISA检测血清和尿液中的 Ang(1-7)以及尿蛋白水平。3.4SOD?口 MDA®量分离肾小球，制备肾小球匀浆，检测肾小球组织SODR MDA 含量。3.5组织病理学检测大鼠肾脏组织切片，PAS染色计算肾小球硬化指数 (GSI) 。免疫组织化学染色检测肾小球内IV型胶原、TGF-B 1、VEGF PCN厌口巨噬细胞含量。3.6细胞培养大鼠肾小球系膜细胞系(HBZY-1)分组：Control组：应用 含 5mmol/1 葡萄糖的培养基培养, 并加入 20mmol/1 的甘露醇以平衡渗透压； HG组： 25mmol/1

40、的葡萄糖刺激 24 小时； S-Ang(1-7) 组、 M-Ang(1-7) 组和 L-Ang(1-7) 组：分别应用50、 100 和 200nmol/1 的 Ang(1-7) 预处理细胞1 小时； Valsartan组： 10-6mol/1 的缬沙坦预处理细胞1 小时； L+V 组：200nmol/1Ang(1-7)+10-6mol/l缴沙坦预处理细胞 1 小时；L+A779组：200nmol/1A779预处理细胞半小时后加入 200nmol/1Ang(1-7)处理1小时。所有药物干预组细胞在药物预处理后应用 25mmol/1 的葡萄糖刺激 24 小时 ,收集细胞。 3.7Western

41、blot 分离并提取肾小球蛋白 ,western blot 检测NOX、4 p47phox、PKCx、 PKC3 1、 TGF-B 1 和 p-Smad3的蛋白表达水平。提取大鼠肾小千系膜细胞系 HBZY-1的蛋白,western blot 检测NOX4 p47phox、TGF-B 1、p-Smad3 VEGFW IV型胶原。试剂盒分离并提取 HBZY-1细 胞的膜蛋白和胞浆蛋白,western blot分别检测两者的PKC丽PKC? 1的蛋白水 平。3.8DHE DCFffi EdU荧光染色各组 HBZY-1细胞在实验结束时应用 DHEffi DCF 染色检测ROSK平。EdU染色检测细胞增

42、殖水平。4结果4.1血清和尿液中Ang(1-7)水平Ang(1-7)干预治疗前，DM大鼠各组的 血清和尿液Ang(1-7) 水平显著低于 Control 组。 但是 Ang(1-7) 干预后 ,血清和尿液中 Ang(1-7) 水平呈剂量依赖性升高。另外与NT组相比，缴沙坦组也能升高Ang(1-7)的含量。4.2血压和血糖检测 DM大鼠的SBPft Control组显著降低，而DM大鼠各组间无显著性差异。DM*鼠血糖水平显著高于对照组，DM大鼠组间无显著性差异。4.3Ang(1-7) 改善肾脏功能与Control组相比，体重和肌酊清除率在NT组显著降低而肾重/体 重、24小时尿量、血清肌酊水平和

43、24小时尿蛋白量在NT组却显著升高，提示DN 造模成功。Ang1-7) 、缬沙坦以及两者联合治疗均能改善上述指标。 Ang(1-7) 的效应呈剂量依赖性，而A779能阻断Ang(1-7)的上述作用。L-Ang(1-7)组和L+V组肾脏功能改善效果相似并且均优于 Valsartan组。4.4 Ang(1-7)减轻肾小球硬化PA哪色并根据其阳性面积计算GSI。结果发现,DM各组的GSI均显著高于Control组。与NT组相比,Ang(1-7)能 剂量依赖性的降低GSI,而A779则能够阻断该作用。L-Ang(1-7)组与L+V组组间GSI无显著性差异，但是此两组的GSI水平均显 著低于Valsartan组。免疫组化显示NT组肾小球内IV型胶原、TGF-0 1、VEGF 和PCN给量均显著高于Control组。Ang(1-7) 、 Valsartan