对于诱导细胞毒T淋巴细胞

1、摘要：对于诱导细胞毒T淋巴细胞（CTL）的可靠和有效的方法一直是研究的热点，本次试验主要在于动物模型的研究，这种动物模型允许测试新颖的疫苗策略并且最终实现一个更有效率的临床试验的计划。在这里，由一串部分重叠的CTL表位（20个人，3只猫猴和1只老鼠）传递和表达人类免疫缺陷病毒（HIV） 疫苗候选人被创建通过使用质体DNA和被修改病毒安卡拉（MVA；一个衰减痘苗病毒）,它们是两种可接受的疫苗工具为了在人类使用。在老鼠中，在单一的静脉肌肉注射后这些疫苗被表现诱导病毒特异性干扰素的产生和细胞毒CD8+TI田 胞，随着免疫试验方案被寻找来提高诱导特异性的 HIV白T细胞水平， DNA首要的-MVA的提

2、升被发现作为最有力的试验方案，这种多态表 位的DNA也引出CTL当用Accell?基因枪传递装置在细胞内传送。基因传递装置（基因枪），最后，一个组合的内部的基因枪 DNA HMVA 疫苗方法诱导在猫猴高频率的循环 CTL,这种高频率CTL与在猴子所 观察到的猿类免疫缺陷病毒（SIV）感染的猴子。对这种方法的优化在 非人类的灵长类也正在进行，因此，为了有效的引出CTL一个免疫的方 法已经被发现，这种方法很可能促进这些淋巴细胞在控制SIV和HIV感染中起评价的作用。关键词： HIV 疫苗； CTL 多态位； DNA 首要的 MVA 的提高1.引言一个有效的疫苗是最希望来控制获得性免疫缺陷病综合症（

3、AIDS）的恐慌。通过保护免疫组织不被人体免疫缺陷病毒 （HIV）感染 的这种疫苗将起帮助的作用，尽管一个 HIV疫苗可能诱导CD8+和 CD4+ T 细胞的反应，以及中和抗体，但是缺乏这些诱导的人群中也能说明这些组成成分在保护中的作用。对于这种方法最主要的障碍是在于识别足够地高的CD8+T 细胞的反应，和识别抗体中和最初的HIV 分离。识别这些反应的疫苗作为重大进展朝着预防HIV 感染或衰减它的方向，从而长期地延缓HIV 的发作。CD8 +T 细胞在参与机体的防御不止一个方面：它们通过杀伤被感染的细胞来阻止病毒的繁殖，和分泌一系列的细胞因子如IFN-r 和肿瘤坏死因素，直接或间接有助于控制病

4、毒的感染。这一新兴的数据显示在CD8 +T 细胞艾滋病病毒感染所有阶段起到了核心的保护作用： CD8 +T 细胞的存在而不是与起初感染的病毒血症控制有关的中和抗体；他们很容易发现许多无症状的个体和围绕着的细胞毒T 淋巴细胞（CTL）多次与逆转病毒的联系，艾滋病的CTL逃逸突变体在某些情况恶化被孤立；随着疾病的进展细胞毒性的降低；在未感染的的人群中CTL 被发现，但是已经感染HIV 的妇女和在未受感染的携带 HIV 病毒的母亲所生婴儿（这句不会翻译）。这是公认的为了实际的和安全的原因，病毒的亚单位而不是全灭活或者是被减弱的艾滋病病毒的制剂极有可能被用来作为AIDS的疫苗。 抗原表位的使用来自几个

5、不同的蛋白在蛋白质数量上的降低了或在接种疫苗时遗传物质的传递，增强免疫应答集中在主要的或者保守的蛋白质区域，降低非重叠的区域（免疫致病原或者免疫抑制）和筛 选混合的单一的多态位点（分支疫苗）。表位疫苗的障碍是MHC的抗原决定簇，这些抗原决定簇引起不同的 T细胞具有不同的抗原表位。然而， 据估计五个常见的人类白细胞抗原类型可能在白人和东方的人群中包括 80-90% ，和由9个人类白细胞抗原分子的表位会被要求对于一般人群覆盖面无关种族血统，如果每个人超过一个相关的表位被需要，一个广泛有效的表位疫苗的复杂性也会增加，而且是可行的。重点对新疫苗的策略的评估是使用动物模型，小动物模型对于起初的免疫原性研

6、究是有用的，这种研究使用大量的动物的成本便宜。对于 HIV 和 AIDS 病毒而言，根据在疾病的严重性和防止病毒感染难点上， 为带有免疫缺陷病毒的非人类灵长类动物的感染提供一系列的模型。这些模型从含有HIV-1 SF2 的黑猩猩的感染到含有SIV_mac的恒河猴的感染，这种感染很容易被中和抗体保护，受感染的部位在部分或完全地依赖细胞介导的免疫反应。这些模型允许免疫设计的重要方面和以更快、更便宜的方法对免疫方案的拟定与在人类中的研究进行比较，并且最终提供更有效率的临床研究计划。此外，一个临床前具有 AIDS 疫苗的人的进展被描述。2 .实验设置2.1 DNA 多 CTL 表位疫苗一个艾滋病疫苗的

7、原型被构造，这基于合成的基因编码对于一系列部分重叠的表位，指定H区。这种CTL多表位肽蛋白质有20个人的 表位（受12个不同的HLA等位基因的限制），3个猫猴表位和1个鼠表 位组成，因此在老鼠,猕猴和人类中同种疫苗可以被测试他们的CTL免疫原性（免疫遗传性），为了使在老鼠中两种不同的表位诱导产生特异性的T细胞，另一个多表位基因包含一个疟原虫鼠科表位与 H基 因末端3%产生HM基因，直接无害的DNA是一种特异性的活性疫苗， 这种疫苗已成功用于诱导体内的体液和细胞介导免疫反应，包括MHC-I 分子的 CD8+T 细胞，一种用于向量镀通孔（一种新型的载体pTH被设计）DNA免疫被构造，用于使H和HM

8、基因被插入。在瞬间转 染的培养细胞内这些载体表达高水平的重组多肽。用DNA疫苗在老鼠静脉肌肉注射产生细胞毒性因子（ 23% 杀死在靶细胞比率为100:1）和干扰素r的产生（300每106脾细胞）CD8+T细胞特异性对于两鼠表 位。2.2 . MVA多CTL表位疫苗MVA是一种减弱痘苗病毒应变而在鸡胚细胞生长得很好，但实质 上失去了它在哺乳动物细胞复制的能力，此外， MVA已失去了几个 基因编码免疫调节蛋白如可溶性的载体对 IFN-r, IFN a:b,肿瘤坏死因 子，CC趋化因子。更为重要的是，MVA已经被证实是安全被用于超过 120万人类。重组的MVA携带H和HM基因被构建，静脉注射小鼠（i

9、.v.） or i.m. 使用单一剂量的106血小板形成单位（pfu） of MVA和CTL的诱导被估 计。研究结果表明两种方式诱导特异性的 CTL反应持续了至少55天， 和在i.v.的途径是缓和地比免疫遗传比i.m.途径多（分别42和33%正 在死亡，防御较多的HIV表位在靶细胞的比率100:1）。ex vivo脾淋巴 细胞的频率产生干扰素与MHC I类分子结合被确定用ELISPOT分 析，每106脾细胞平均283和227个细胞各自在i.v. and i.m.的HIV表 位。3 .结果3.1 T细胞诱导的增强由一个起初的DNA MVA疫苗方法的提高 我们探究免疫的方案，该方案将能够提高诱导H

10、IV特异性T细胞的水平。据发现之前的免疫对MVA 暴露， MVA 降低之前的效果和使用相同的疫苗的方法加强。然而，以动物重组的方法是第一个带有DNA的疫苗，和MVA提高是最有力的方案适合于在干扰素r的产生 （ 1000个细胞每106脾细胞）和细胞毒 （ 55%杀死靶细胞的比率是100：1） CD8+T细胞对两个CTL表位的不利。3.2 Accell基因枪传递能够在一种双模型的疫苗方法替代 DNA的注射 基因枪介导的免疫传递被包裹的DNA金粉颗粒进入表皮，一个主 要的免疫诱导位点，和要求在灵长类动物中少于100 1000的重复序列。通过内部肌肉时有很多重要的优势， 具有多表位DNA载体的CTL的

11、有效诱导被实现通过疫苗，这种疫苗是使用基因枪或者重组疫苗的方法（70%杀死靶细胞的比率是100: 1）。因此，携带多CTL表位基 因的基因枪介导的免疫和能够在 DNA起初MVA提高疫苗方案中替 代注射 DNA。3.3 在非灵长类动物中诱导高水平的CTL在过去， 一些在小鼠内的疫苗免疫遗传不能诱导在人体内的免疫反应。因此，测试多表位疫苗在人类的临床试验是十分重要，这个疫苗含有一个MHC等位基因抑制SIV的表位和三个MHC等位基因激活SIV的表位，和三个Mamu-A*01阳性 恒河猴使用PCR-SS限术被选 择，以及用Accell基因传递装置的DNA疫苗的二倍被用5x108pfu的 MVA （周1

12、7 22周）两种胞内免疫，在最后的免疫之后 PBL被隔离 一周，在细胞外的肽的表达和CTL 的溶解的确定。这种疫苗的方法诱导CTL的反应，该反应的结果是分别加入48,50和66%肽特异性与靶细胞的比率高各自是37:1,45:1 和 14:1, 35周溶血的淋巴细胞能够裂解PHA刺激SIV感染的PBL。高频率循环的SIV特异性T细胞被疫苗诱 导，这种T细胞被证实通过使用可溶性四聚体 Mamu-A*01-肽复合物和 波动达到CD8+淋巴细胞的最大值1 % （未出现的结果），因此DNA 首要的MVA提高疫苗方案诱导的有效性和持续性地的高频率的 CTL 不仅在小鼠中存在，而且在非人类的灵长类的动物与人

13、类的尺寸比较和免疫反应比较接近，抵御SIV感染的疫苗有效性被检测。人类CTL的克隆和对四种HLA限制HIV表位的方法用来检测这些表位加工和呈递的过程在受感染的具有MVA.H 或 MV.HM 人类细胞是可靠的，所有的这四个表位完全的来源于人类细胞，并且CTL 裂解这些敏感的受感染的靶细胞。4 . 讨论4.1 为什么DNA-MV A方法诱导CTL是有效的？这项研究中通过筛选HIV 疫苗有几种可能的原因对于诱导有效的 CTL。 首先， 两种疫苗接种于表皮，在表皮这些多表位蛋白被最大量的产生通过角质化细胞和Langerhans 细胞。这些抗原呈递细胞在抗原集中的部位是最有效的抗原识别和介导免疫反应的细

14、胞，在老鼠体内，比起在静脉肌肉注射中这种免疫途径是更有效的，其次，基本的免疫反应是使用DNA 作为免疫工具，为了获得起始的CTL 重组免疫原，简单的说是因为仅仅只是一个外源蛋白的表达，尽管重组天花病毒很可能有较多的免疫基因比DNA 载体作为免疫工具，但是病毒感染细胞能产生大量的病毒多肽位点由MHC I 类呈递， MHC I 类分子能够竞争重组免疫原为CTL 免疫瞄定。以前，尽管所有的这些疫苗反应是针对牛痘抗原，但是仅有少数的疫苗被免疫即用重组的疫苗对细胞内的蛋白进行免疫。因此，提高 MVA， DNA 靶动物已经极大地提高特异性免疫原CTL 的活性。 第三， 使用 MVA 而不是牛痘病毒或天花病

15、毒是很有用的，由于特殊的免疫调节分子的爆发即MVA 的表达。 MVA 产生强烈的I 型干扰素反应，这很可能用于CTL的表达，第四，这种特异性的多CTL, 表位在转染的细胞中是无毒，归因于一系列的多肽进入大的胞囊泡中。细胞长时间的产生免疫原，直到免疫应答清除。最后， 一些机体出现的数据表明具有不同的疫苗方法重组的疫苗方案，或者是对于免疫系统的抗原呈递诱导的免疫反应时是十分有效的。4.2 CTL 怎样预防免疫缺陷病毒的感染？CTL本身不能够阻止受感染的宿主T细胞内的病毒细胞，但是， 如果在相关的组织或者其周围有高剂量的记忆 CTL呈递细胞，和病毒 的感染性很低时，CTL能及时清除这些小量的感染细胞

16、在病毒迅速传 染和产生子代病毒时。在人类中，能鉴别 HIV特异性的CTL反应的发 生，但是未感染的类群上升的可能性，CTL可能保护或者防御HIV病毒的感染。在SIV猫猴模型中，控制SIV的感染与MHC I类分子的 Mamu-A*26等位基因有密切的联系，使用四聚体复合物，同样的 Mamu-A*01-被抑制肽在这次研究中被使用表明在受SIV感染的猴子中免疫占主导并地位，然而，到目前为止已经有两项研究携带疫苗诱导的 CTL 的动物在抵制这种表位上遭到质疑，和不完全地被保护，尽管有所下降在病毒被观察到（S. Norley, Paul-Ehlrich 研究所），在这些研究中CTL 的水平可能比在我们所研究的动物中低一些，预防 SIV感染的措施需要依靠疫苗诱导的CTL 的强度， 和 12-肽 p11C 被用来提高在以前的研究中可能已经诱导潜在的CTL 反应，抵制蛋白质的表达的高水平的CTL 在再生循环中能更好的阻止感染比晚期结构蛋5 .结论最初的多CTL 表位 AIDS 疫苗被构建通过对这些疫苗的选择为了适合应用于人类，在老鼠中它们的免疫遗传性被证明和一个混合的免疫方