慢病毒使用操作手册

1、慢病毒使用操作手册病毒包装是生物医学研究中的一大利器。通过病毒我们可以高效地让我们要研究的基因 在目标细胞中过表达或者特异性地敲低细胞中的目标基因。科研中用到的病毒主要有慢病毒、腺病毒、腺相关病毒。根据各种病毒不同的特性，不同的课题需要包装不同的病毒。比如， 腺相关病毒更适合进行动物在体研究。腺病毒具有包装容量大、适合在体研究等有点。生物医学科研中使用得较多的是慢病毒，慢病毒具有外源基因容量大、目的基因整合稳定表达、可同时感染分裂和非分裂细胞、转染效率高的特点， 已经广泛应用于基础科研、临床研究中。1、预实验的重要性文献报道或他人经验中的MOI （感染复数，毒粒与被感染细胞的数量比值），不仅取

2、决于病毒对细胞本身的亲噬性，而且受到不同来源重组病毒滴度测定误差、使用保存过程损失、具体细胞状态、传代次数、细胞密度、具体实验操作等方面的影响。完全照搬MOI可能并不能达到更佳效果。传代细胞系、原代细胞等材料，实际状态在各个实验室也会存在一定差异。预实验的目的是找出能够达到更高感染效率、同时细胞状态未受到明显影响的一个恰当病毒用量。2、预实验安排设置不同MOI值的感染组。可设立 5、10、20、50的感染复数梯度，各两孔，一孔加入 终浓度为5 ug/ml的polybrene ,另一孔不加。如果只需通过荧光显微镜观察，则使用 96 孔板即可。如需做 Real-time PCR或流式检测则至少使用

3、 24孔板。在6 h、12 h、24h左右 观察总结感染细胞状态，在 72 h左右检测感染效率及表达水平。如为RNAi需检测蛋白水平下调可进一步延迟 24 h。如果有文献报道的 MOI值，可使用该值的 0.5x、1x、2x、4x进行测试。如使用较难感 染的细胞进行实验，建议设置易感染细胞组如293、Hela、A549等作为阳性对照。为了便于实验应用，且培养体系中的实际细胞数量存在计数误差， 用量预实验的结论可 总结为一定培养规模（如 96孔板、6孔板）下、一定细胞密度时（如 60%）、原始毒液加入 体积（如5 6）。当需要放大或缩小实验体系时，可根据培养面积（对应细胞数）按比例换算得出病毒用量

4、。3、感染方法（以24孔板为例）第一天，准备感染细胞。在24孔板中接种目的细胞约 5x104/孔，每孔培养基体积0.5 ml。 目的细胞的状态对于感染及表达非常重要。第二天，冻存待用的病毒于冰上融化， 如需稀释毒液可以用培养基进行稀释（基础培养基或完全培养基均可， 血清、双抗不影响病毒感染）。 观察前一天准备的细胞，状态良好，进行病毒感染时细胞的汇合度约为50-60%左右。按滴度计算毒液所需的用量。 如原始滴度为1x108 TU/ml ,每孔拟病毒用量为0.5x10 6 TU, 则需要使用原液 5 ul。将所需用量的毒液加入完全培养基（500ul）、混匀，吸除孔板中原培养基，加入混合毒液的培养

5、基。放于二氧化碳培养箱（37C、5%C0孵育培养。根据细胞状态更换培养基，如状态良好可在12-16h更换培养基，病毒明育时间不短于4 h o需要使用polybrene时，在孵育培养基中先于毒液加入例如5科g/ml终浓度的polybrene混匀。按照正常培养基条件继续培养48-72 h后可检测感染效率。在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。如载体未携带标记基因的，可以通过 Real-time PCR佥测 目的基因表达。慢病毒表达产物在72-96 h左右接近高峰，如细胞生长代谢缓慢需适当延长时间，生长旺盛的细胞在 48 h即可观察基因表达。4、实验参考信息（1）常用细胞系参考MO

6、I值 80%染率所需MOI细胞名称中文名称293T人胚肾上皮细胞1A375人黑色素瘤细胞10A498人肾癌细胞100A549人肺腺癌细胞20A673人横纹肌瘤细胞10ACHN人肾癌细胞10AGS人胃癌细胞100AsPC-1人胰腺癌细胞10B16小鼠黑色素瘤细胞> 100BEL-7402人肝癌细胞10BGC823人胃癌细胞100BRL大鼠肝细胞20BRL-3A大鼠肝细胞100BTT小鼠膀胱癌细胞20C127小鼠乳腺癌细胞100C6大鼠脑胶质瘤细胞> 100Capan-1人胰腺癌细胞10CFPAC-1人胰腺癌细胞50CHO中国仓鼠卵巢癌细胞20CNE人鼻咽癌细胞10CNE2人低分化鳞癌

7、鼻咽癌细胞50COC1人卵巢癌细胞> 100Daudi人Burkitt ' s淋巴瘤细胞> 100DLD-1人结直肠肿瘤细胞10DU145人前列腺癌细胞20EC9706人食管癌细胞10Eca109人食管癌细胞20GBC-SD人胆囊癌细胞30GH3大鼠垂体腺瘤细胞100HaCaT人永生化表皮细胞> 100HCC1937人乳腺癌细胞50HCT116人结直肠癌细胞10Hela人宫颈癌细胞株10HepG2人肝癌细胞10Hep-2人喉癌细胞10Hepa 1-6小鼠肝癌细胞100hFOB 1.19人胎儿成骨样细胞20HL-60人急性髓系白血病细胞> 100HL-7702人肝

8、正常细胞20HOS人骨肉瘤细胞20HSC-T6大鼠肝星形细胞10HT-29人结肠癌细胞10Huh-7人肝癌细胞10HUVEC-2C人脐静脉血管内皮细胞10IEC6大鼠肠上皮细胞株10JB6小鼠表皮细胞> 100JEG-3人绒癌细胞系100Jurkat人T细胞白血病细胞50K562人慢性髓性白血病细胞20KB人口腔上皮癌10L6大鼠成肌细胞50Lewis小鼠肺癌细胞20LNCaP人前列腺癌细胞5LoVo人结肠癌细胞10MCF-7人乳腺癌细胞20MDA-MB-231人乳腺癌细胞10MDA-MB-468人乳腺癌细胞10MDPC-23小鼠成牙本质细胞样细胞> 100MG-63人成骨肉瘤细胞

9、株50MGC-803人胃癌细胞50MIN-6小鼠胰岛素细胞100MKN-28人胃癌细胞株20MKN-45人胃低分化腺癌细胞株20MOLT-4人T淋巴细胞白血病细胞株> 100MRC-5人胚肺成纤维细胞10NB4人白血病细胞50NCI-H125人肺腺癌细胞> 100NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞系20NRK大鼠肾细胞100PANC-1人胰腺癌细胞2PC-3人前列腺癌细胞20Raw264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞10RKO人结肠癌细胞2RPE人视网膜色素上皮细胞10Saos-2人骨肉瘤细胞10SCaBER人膀胱鳞癌细胞200SEG-1人食管腺癌100SGC-7901人胃癌细胞10

10、SHG-44人脑胶质瘤细胞10SHZ-88大鼠乳腺癌细胞20SK-BR-3人乳腺癌腹腔转移癌细胞株50SK-N-SH人SK神经母细胞瘤20SK-OV-3卵巢癌细胞株2SMMC-7721人肝癌细胞10SPC-A-1人肺腺癌细胞100SW1990人胰腺癌50SW480人结肠癌细胞10SW620人结肠癌细胞100SW982人滑膜肉瘤20T24人膀胱癌5T-47D人乳腺癌细胞50Tca8113人舌鳞状细胞癌细胞10THP-1人急性单核细胞白血病细胞50U2 OS人骨肉瘤细胞5U251人脑胶质母细胞瘤10U87人脑星形胶质母细胞瘤3U937人单核细胞50Vero-E6非洲绿猴肾细胞5(2)常用培养器皿使

11、用参数种类底面积(cm 2)培养基工作体积(ml)平均细胞产量96孔板0.320.1 - 0.23.2 x 10448孔板0.950.2 - 0.39.5 x 10424孔板1.90.4 - 0.61.9 x 10512孔板3.80.8 - 1.23.8 x 1056孔板9.5239.5 x 105100mm 皿558-155.5 x 106150mm 皿15225 - 401.5 x 107T75瓶7515 - 227.5 x 106T175 瓶17530 - 501.75 x 107二、在任何事情上都不要觉得自己受了多大的委屈，哭哭啼啼和别别扭扭改变不了糟糕的现状。心子开一点，认真地该干啥

12、干啥，反倒走得顺畅许多。扛得住多少东西，最后就会得到多 少东西，大致就是这么个理儿吧。三、生命本没有意义，你要能给他什么意义，他就有什么意义。与其终日冥想人生有何意义，不如试用此生做点有意义的事。四、爱怕沉默。太多的人，以为爱到深处是无言。其实，爱是很难描述的一种情感，需要详尽的表达和传递。五、有些路，只能一个人走。六、有一种落差是，你配不上自己的野心，也辜负了所受的苦难。七、有些决定，只需要一分钟，可是，却会用一辈子，去后悔那一分钟。八、忽然想通了 ”这五个字说来简单，要做到可真不容易。我佛如来在菩堤树下得道，就因为他忽然想通了 ”达摩祖师面壁十八年，才总算忽然想通了 "无论什么事

13、，你只要能 忽然想通了 "你就不会有烦恼，但达到这地步之前，你一定已不知道有过多少烦恼。九、如果他总为别人撑伞，你何苦非为他等在雨中。十、我对前任的感觉很简单，哪怕他的女朋友来我面前秀恩爱，我也不会觉得烦。就像在看别人吃一碗很香的卤肉饭，吧唧嘴巴弄得很大声，但我自己心里是明白的：我吃过那种饭，其实没那么好吃。十一、为什么我们总是不懂得珍惜眼前人？在未可预知的重逢里，我们以为总会重逢，总会有缘再会，总以为有机会说一声对不起，却从没想过每一次挥手道别，都可能是诀别，每一声 叹息，都可能是人间最后的一声叹息。十二、我在最好的时候碰到你，是我的运气。可惜我没时间了。想想，说人生无悔，都是赌气

14、的话。人生若无悔，那该多无趣啊。我心里有过你。可我也只能到喜欢为止了。十三、我说不出来为什么爱你，但我知道，你就是我不爱别人的理由。十四、当你在转圈的时候，这个世界很大，当你勇往直前，这个世界就很小。十五、现在男女之间的恋爱，总是答应太快，结果分手也快。人性的规律是容易得到的就容易放弃。凡是通过努力得到的，不管是感情还是物品，都会使人顿生珍惜之感。所以 在感情上，当有人追求时，内心的一份矜持是必要的，即使心里很爱，也需要给追求者时间和难度，这样两人走到一起才会珍惜感情、地久天长。十六、我从来不会在分手很久后才会哭，因为不值。十七、高兴呢，就允许自己高兴一天；难过呢，也允许自己难过一天。关键是这

15、一天过去了，你得继续往前走。十八、对于世界而言，你是一个人；但是对于某个人，你是 TA的整个世界。十九、我们渐渐的放开了对方的手二十、为爱投入不应该被苛责，只是忘记自己却是爱情里的最大弊病，也许，爱情里最好的状态不是牺牲与忍让，而是站在可以看到彼此的位置里，在对方的眼里可以看到最真实的自己。二十一、人生一世，总有个追求，有个盼望，有个让自己珍视，让自己向往，让自己护卫，愿意为之活一遭，乃至愿意为之献身的东西，这就是价值了。二十二、 做自己”很难，但更难的是遇到能接受你做自己”的人。二十三、只有在你最落魄时，才会知道谁是为你担心的笨蛋，谁是形同陌路的混蛋。二十四、老天在送你一个大礼物时，都会用重重困难做包装。二十五、很奇妙的一种感觉是，曾经的陌生人，突然之间成为了你的整个世界。我们不可能再有一个童年；不可能再有一个初中；不可能再有一个初恋；不可能再有从前的快乐、幸福、悲伤、痛苦。昨天，前一秒，通通都不可能再回去。生命原来是一场无法回放的绝版电影！二十六、有时阳光很好，有时阳光很暗，这就是生活。二十七、再多的 我爱你”也抵不过一句 分手吧”二十八、失望，有时候也是一种幸