植物切片制作

1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流植物切片制作.精品文档.植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，是人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分。植物制片技术已建立了许多方法，现简要介绍如下几种最常见的制片技术：徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰冻切片法。徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。优点：简单、方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。用品与材料显微镜、载（盖）玻片、刀片、

2、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O或清水、1%番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯实验材料 对于软硬适中，便于手持的材料，可将实验材料截成适当小块，一般以长23cm，切片断面不超过35mm2为宜。对于过于柔嫩的器官（如叶片等），一般可选用胡萝卜根、土豆块茎等作为支撑物，包被住材料后再进行切片。有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片。实验步骤 1、在小培养皿中放入ddH2O或清水。2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖上面。3、右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。4

3、、切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中。用毛笔挑选透明的薄片，放在载玻片上，用吸管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。注意事项1、在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。2、切片时，两只手应该保持活动状态，不要使它们紧靠身体或实验台，且用力不要过猛，不能用刀片挤压材料或来回切割材料。3、动作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形状的完整。简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片，可以进行简单的组织化学染色，这样更容易分辨细胞的结构，同时可以观察到细胞各部分的化学成分。一般选用以下几种染料进行染色：1、1番红水溶液木质化、栓质化的细胞壁及细胞核染成红色。 2、25硫堇水

4、溶液组织呈现从粉红到蓝紫的多色反应，区分含纤维素、木质素的细胞壁。3、5%间苯三酚反应木质化的细胞壁成红色，颜色深浅与木质化程度有关。 4、I2KI染色淀粉粒呈蓝色，细胞核呈黄色。视课上实验进展情况，另外安排显微镜下观察动植物组织装片。压片法（简要介绍，补充实验 洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察） 压片法是植物的器官或组织未经处理或经过处理后，被涂抹或压在载玻片上，使细胞成一薄层，便于进行观察的一种制片方法。 压片法的实验步骤包括：取材、预处理、固定、解离、染色、压片、镜检和制成永久制片等。实验步骤 1、取材：用锋利的双面刀片截取生长良好的植物根尖或茎尖，长度不超过3mm。 2、预处理：利

5、用预处理液如秋水仙素、对二氯苯等处理材料，使细胞分裂停留在有丝分裂的中期，并使染色体缩短变粗。预处理的时间视不同植物而定。观察有丝分裂各期特点和减数分裂的幼小花药的制片不需要预处理。 3、固定：用固定剂迅速杀死正在分裂的细胞，使其尽量保持分裂的状态。常用的固定剂是卡诺固定剂，固定时间l24h。 4、解离：用酶或盐酸处理固定后的材料，使正在分裂的细胞分离，便于压片。解离时要掌握好时间，特别是用盐酸解离时，时间过短，细胞不易分开；时间过长，则染色困难。5、染色：常用碱性品红或醋酸洋红等染核的染料进行染色。 6、压片：压片时，将新鲜的或经固定的材料放在载玻片上，用解剖刀或镊子后端压住材料，并往载玻片

6、的另一边拖，注意用力均匀。也可以将载玻片上的材料盖上盖玻片，用解剖针、竹毛衣针或铅笔轻轻敲击，使组织或细胞分散，再用拇指挤压盖玻片，使细胞成一薄层。前者常用于花粉和小孢子母细胞，后者用于根尖、茎尖和幼叶等幼嫩器官。7、镜检：将压片置于显微镜下观察，选取目标细胞。用记号笔在载玻片和盖玻片上分别作记号。8、照相或制成永久制片：好的压片可以直接照相，也可以通过冷冻干燥后制成永久制片。滑走切片法（补充）滑走切片法是利用滑走切片机切新鲜的或保存的材料，亦可以切经由石蜡制片法包埋的材料。此法切出的切片厚薄均匀、结构完整，适用于一些比较坚硬的材料。 用品和材料 实验用品 显微镜、滑走切片机、切片刀、载玻片、

7、盖玻片、双面刀片、毛笔、培养皿、滤纸、滴管和软木。 实验材料 新鲜材料，若直径小于lcm，可分割成3cm长的小段；若大于lcm，则应将材料劈开，使切面的面积小于lcm2为宜。新鲜材料可直接用于切片，也可以经处理后再进行切片。处理时，用FAA固定液固定一天，然后转入软化剂如甘油、氢氟酸中软化，软化时间视不同材料而定。在木材制片时，也可以用水煮法排出木材中的空气并软化部分组织，然后转入软化剂乙二胺中，软化合适后，用聚乙二醇包埋。经由石蜡制片法包埋的材料也可以利用滑走切片法切片。实验步骤 滑走切片机由机身、升降夹物装置、切片刀的夹刀滑行部分等组成。先把切片刀固定在夹刀上，然后将材料固定在两片软木中，

8、材料露出木片约0.5cm，再固定在切片机的夹物装置上。调好材料的高度，使刀刃靠近材料的切面，并使材料与刀刃平行。调整厚度调节器，使其符合切片的要求。切片时用右手扶切片刀的夹刀滑行部分，均匀用力往自己方向移动，切片便被切下并粘在刀的表面上。用湿毛笔把切片取下，放入盛水的培养皿里，然后把刀推回。当把刀向后推时，夹物装置就按调节好的厚度上升。如此循环往复。可将切片制成临时装片或进行简单的显微化学染色后观察，亦可以通过固定、脱水、染色和封固等程序，制成永久制片。离析法（补充）离析法是用一些化学药品使细胞间的胞间层溶解，细胞彼此分离，从而得到单个、完整细胞的方法，便于研究细胞的立体结构。 1、铬酸-硝酸

9、离析法 适用于木质化组织，如木材、纤维等。把材料切成长约lcm、火柴棒大小的小条，放人小玻璃管中，加入离析液，其量约为材料的20倍。盖紧瓶盖放在3040的温箱中。离析的时间，一般12天。如果2天后仍末离析，可换新的离析液，再放置几天，时间因材料的性质而异。检查材料是否离析，可取出材料少许，放在载玻片上，用解剖针末端轻轻敲打，若材料分离，表明离析时间已够。这时移去离析液，用水清洗干净，保存在50或70的酒精中备用。 2、盐酸-草酸铵离析法 适用于草本植物的髓、薄壁组织和叶肉组织等。把材料切成小块，约lcm×0.5cm×0.2cm大小，放入3:1的70或90酒精和浓盐酸中。若材

10、料有空气，应抽气，抽气后更换一次离析液。24h后，用水清洗干净。放入0.5草酸铵水溶液中，时间的长短视材料的性质而定。可以每隔l2天作检查。其余与上法相同。石蜡切片法（补充） 石蜡切片法是用石蜡作为包埋剂的一种显微制片方法，是显微技术中最重要最常用的方法之一。它的优点是能够切出薄而均匀的连续切片，便于进行器官的三维重构。此法多用手摇切片机切片。对于较硬的材料，也可以使用滑走切片机。 石蜡切片法的操作程序包括：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、粘片、染色和封片。 实验步骤1、取材：选取生长良好、有代表性的目标材料，洗净。用锋利的双面刀片截取材料，动作要迅速。材料的大小不超过0.5l

11、cm3。 2、固定：将选取的材料放人固定液中，固定液的体积大约是材料的20倍。固定是用化学试剂迅速杀死细胞的过程。目的是尽可能使细胞中的各个组分保持生活状态的结构，并固定在它们原来的位置上。常用的固定剂有FAA、卡诺和纳瓦兴固定液。前两种固定液的固定时间是224h，后者是1248h。FAA既是良好的固定剂，也是保存剂，材料可以在其中长久保存。而卡诺固定液和纳瓦兴固定液则不能长久保留材料，固定后，应尽快清洗，转人70%酒精中保存。若材料含有空气，固定时需要抽气。 3、脱水：固定好的材料经各级酒精脱水至纯酒精。各级酒精的浓度为：30%、50%、70%、85%、95%和l00%。 4、透明：纯酒精中

12、的植物材料用l/2纯酒精和l/2二甲苯混合液处理23h，转入纯二甲苯中，处理两次。由于石蜡溶于二甲苯而不溶于酒精，因此透明的作用除了使材料变得透明外，另一方面是将材料中的酒精除去。 5、浸蜡：使石蜡慢慢溶于透明剂中，然后完全取代透明剂进人植物组织中。一般将透明好的材料换入新的二甲苯中，然后加入等体积的碎蜡，置于40左右的温箱中。随着碎蜡的溶解，不断加入碎蜡使石蜡饱和为止。时间大约l2天。 6、包埋：浸蜡后，在60的温箱中，换两次已溶解的纯蜡，每次约2h。然后将材料和石蜡一起倒人小纸盒中，用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐，再将小纸盒平放于冷水中，使其很快凝固。 7、修块：将

13、包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料。然后按需要的切面将蜡块切成梯形，切面在梯形的上部，注意上部矩形的对边平行。梯形的底部用烧热的蜡铲将其固定在木块上。 8、切片：用手摇切片机将蜡块切成连续的蜡带。切片时，把切片刀夹在刀架上，再把木块夹在固定装置上，调整固着位置，使材料的切与面刀口平行。然后调整厚度，转动切片机切片。 9、粘片：粘片是将切好的蜡片粘在载玻片上。在洁净的载玻片上，加少许粘贴剂并涂匀。然后加几滴3%福尔马林或蒸馏水，用解剖针或镊子轻轻将蜡片放在液面上。再将带有蜡片的载玻片放在温台上，温台的温度在45左右，蜡片受热后慢慢伸直。用滤纸吸去多余液体，表面烤干后，转入30温箱放置一

14、昼夜。 10、染色和封片：切片干燥后，可以选用不同的染色法染色。染色前先要进行脱蜡，使材料内外的石蜡溶解。然后根据配制染液的溶液情况，决定是否需要复水。下面以植物生物学中最常见的番红-固绿染色方法，说明染色与制片过程。冰冻切片法（补充）冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。低温恒冷箱冰冻切片法目前应用得比较多。实验步骤 1、取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整。 2、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴

15、上包埋剂。 3、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 4、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在510um间。 5、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 6、应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。 注意事项1、防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干

16、净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2、多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 3、放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 4、组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 5、当切片时，