种子制备和菌种保藏

1、第三章第三章 种子制备与菌种保藏种子制备与菌种保藏第一节第一节 概概 述述一、种子制备一、种子制备种子制备是抗生素发酵生产的第一道工序，也是重要的工序。定义：定义：利用生产菌种，在一定的条件下，经过扩大繁殖，成为具有一定质量和数量的纯种，供给抗生素生产使用。包括两个过程： 孢子制备孢子制备：生产大量孢子 摇瓶种子制备摇瓶种子制备：生产大量种子菌丝又可分为：实验室制备阶段与生产车间制备阶段二、菌种保藏菌种保藏目的：目的：保持菌种的生活力及其优良性能斜面沙土管冷干管液氮管实验室种子制备生产现场种子制备 二级斜面一级斜面 米孢子 母瓶 子瓶 一级种子罐 发酵罐 二级种子罐 三级种子罐菌种保藏生产种子

2、制备的一般流程生产种子制备的一般流程几个概念几个概念1. 种子罐级数种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。 种子罐级数确定根据：（1）菌种生长特性（2）孢子数量（3）孢子发芽及菌丝繁殖速度（4）发酵罐的接种量2. 发酵级数：发酵级数：种子罐的级数加一。二级发酵，即一级种子扩大培养，如青霉素，四环素；三级发酵，即二级种子扩大培养，如红霉素、庆大霉素；四级发酵，即三级种子扩大培养，如链霉素。种子级数愈少，愈有利于简化工艺和控制，并减少了因多次接种而产生污染的机会。3. 接种龄：接种龄：生产种子的培养时间，即指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间。接种龄以菌丝处于生命力极

3、为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时为宜。4. 接种量接种量：指移入的种子液体积与接种后培养液体积比例。最适接种量为715%。第二节第二节 种子制备种子制备 一、一、 斜面种子的制备斜面种子的制备1. 斜面种子：斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。2. 制备流程：制备流程：3. 制备过程注意事项制备过程注意事项 ： (1) 琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5% (2) 营养液中最好不含易沉淀的固形物； (3) 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3； (4) 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水 (5) 微量元素先配制成

4、一定的溶液，用移液管定量加入在无菌间超净工作台进行接种操作在无菌间超净工作台进行接种操作 3. 质量检查质量检查 （1）外观检查（菌落的形态、色泽、稀密度、孢子量、色素分泌）（2）无菌检查（3）摇瓶生产能力检查 4. 影响斜面种子质量的因素影响斜面种子质量的因素 (1)原材料质量，水质，培养基pH (2)灭菌条件 (3)接种量 (4)培养室温度、湿度、通风 (5)培养时间 (6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯） (7) 冷藏条件二二 、米粒种子（米孢子）、米粒种子（米孢子） 1. 米孢子：米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。2. 米孢

5、子制备工艺流程米孢子制备工艺流程3. 制备过程注意事项制备过程注意事项（1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连； （2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度 （3）米粒不要碰到瓶塞； （4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。 （5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存 4. 质量标准质量标准 （1）无杂菌污染 （2）孢子数足够，发芽率高 （3）生产能力高 (4) 真空干燥后含水量小于10%5. 影响质量的因素及控制影响质量的因素及控制（同前）三、种曲（培养材料用麸皮、米糠等，其余同三、种曲（培养材料用麸皮、米

6、糠等，其余同米粒种子）米粒种子）四、摇瓶种子四、摇瓶种子 1.摇瓶种子摇瓶种子 : 将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。 2.制备流程制备流程 : 3.制备过程注意事项制备过程注意事项 培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/ 750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上；3) 灭菌时要注意不要让

7、蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上4）注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。 5） 注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差 摇瓶种子制备流程摇瓶种子制备流程3.质量检查质量检查：( 1) 菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。( 2) 菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况。( 3) 代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。( 4) 生产能力：摇瓶发酵试验。( 5) 污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查 4. 影响质量的因素影响质量的因素 五、发酵罐种子五、发酵罐种子1.制备流程制备流程 ： 斜面、摇瓶或米粒种斜面、摇瓶或米粒种子子 培养基配

8、制培养基配制 实罐或连续灭菌实罐或连续灭菌 冷却冷却 火圈或压力差接种火圈或压力差接种 培养培养 发酵罐种子发酵罐种子 2 .2 .制备过程注意事项制备过程注意事项培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基丰富，控制培养基成份的合理配比2) 接种方式：一级种子罐：火圈保护接种法火圈保护接种法和压差法压差法二级种子罐：压差法：压差法3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50），搅拌转速也要适当。4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵5） 通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围 6）控制合适移种量： 确定合适的移种量：过大或过小都对发酵有

9、不利影响 掌握种子罐的放罐体积。压差法接种操作示意种子罐1 发酵罐1 发酵罐2种子罐2移种方式：移种方式：1）单种2）双种3）倒种4）混种3.3.质量检查及质量标准：质量检查及质量标准：1）不污染杂菌 2 2）菌体生长阶段（种龄）：处于对数生长期后期，菌体量未达到高峰3）菌体浓度： 菌体浓度的测定方法：离心沉淀法、光密度法、细胞记数法等4）糖、氮、磷代谢情况5）种子液pH 6）摇瓶试验的发酵水平7）特异性酶活力种龄对发酵的影响种龄对发酵的影响4. 影响质量的因素影响质量的因素5. 种子代谢缓慢种子代谢缓慢原因分析分析 空气温度偏低 局部烫伤 培养基原材料质量差 培养基灭菌温度太高，营养成分破坏

10、多 无机磷量低 接种量太小 前一级种子质量太差 泡沫多通气差第三节第三节 菌种保藏菌种保藏定义：定义： 将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。一、条件及原理一、条件及原理 1. 低营养2. 干燥3. 隔氧4. 低温 降低代谢速率或使细胞处于休眠状态(孢子、芽孢等）5. 密封 保持干燥、隔氧、纯粹 二、常用的菌种保藏方法二、常用的菌种保藏方法单纯传代保存法（斜面或穿刺）单纯传代保存法（斜面或穿刺）斜面法：斜面法：实验室和工厂菌种室常用的保藏法，适用于细菌或酵母。适用于细菌或酵母。方法：从沙土管、安瓿管或其它藏物内取出少量菌种或制成悬浮液接入新鲜

11、的斜面上，在一定的温度下培养，生长成熟后，2-4冰箱保存。优点优点：是操作简单，使用方便缺点缺点：是保存期短，在不断的传代过程中，菌种容易变异，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。2. 结合单孢子分离的传代保存法结合单孢子分离的传代保存法斜面孢子悬浮液稀释涂布单细胞分离培养挑菌高产菌株的筛选高产菌株的保藏4冰箱，3-6个月 适用于适用于遗传不稳定的菌种遗传不稳定的菌种, 既保藏了菌种，又保持了生产能力3. 石蜡油封藏法石蜡油封藏法方法：方法：在长好菌的斜面试管中，加入灭过菌的液体石蜡，可防止培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，从而降低微生物的代谢活动，推

12、迟细胞老化，延长保存时间。优点：优点：保存期比斜面低温法保存时间长，适用范围广，真菌、真菌、放线菌放线菌都适用。4. 沙土管保存沙土管保存保存抗生素生产菌常用的方法，目前使用最广泛的保藏方法。优点：优点：效果好，操作方便，保存期可达一年以上方法：方法：将处理过的细沙与土按1：2混合，分装沙土管中1cm高，加棉塞，于121 灭菌1h，间歇灭菌3-5次。接孢子悬液于沙土管中，抽真空。干燥后于4冰箱中保存。1-3年保存期。适用于适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏的保藏5. 米孢子保存米孢子保存步骤与米孢子的制备类似密封，4冰箱3-6个月；真空抽干后密封，保藏6-12

13、个月。 适用于适用于霉菌霉菌的保藏的保藏6. 低温冻结保藏法低温冻结保藏法将保存的菌种（孢子或菌体）悬浮于灭菌的10%-20%甘油或二甲亚基亚砜保护剂中，低温冰箱（-20 -70）冻结。保存温度视菌种不同而异，保存期1-2年。优点：优点：存活力高，变异率低，使用方便7. 冷冻干燥管保存（冷冻干燥管保存（lyophilization freeze-drying )原理：原理：在较低的温度下，即-15 以下，快速将细胞冻结，并且利用保护剂（脱脂牛奶或血清）保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此微生物一般可保存5-10年。优点：优点：保

14、存时间长，存活力高，变异率低缺点：缺点：制备工艺较复杂，需要保护剂、真空干燥和冷藏设备，费用较贵。方法：方法： 收集菌种 灭菌脱脂牛奶或马血清作为悬浮介质 灭菌安瓿管 预冻 低温真空冻干 密封， 适用于适用于一切微生物一切微生物的保存的保存。 细胞 10%-20%甘油作为悬浮介质 分装入安瓿瓶内 预冻 置液氮内（-196）， 适用于适用于所有微生物、动物和植物细胞所有微生物、动物和植物细胞的保存的保存液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法原理：原理：微生物在-130 的低温下，所有的代谢活动都暂停而生命 延续，微生物菌种得以长期保存。保存期：515年。优点：优点：存活率高，稳定性强，保存期最长，适用

15、范围最广缺点缺点：需具备液氮和超低温冷冻条件，不易推广，一般保存经济价值较高的菌种。方法：方法：9、基因工程菌的保藏、基因工程菌的保藏 由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。 一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。 当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。第四节第四节 菌种保藏机构的简介菌种保藏机构的简介菌种是一个国家的重要生物资源

16、，所以菌种保藏是一项重要的菌物学工作。随着科技的进步和生产的发展，对菌物资源的利用正在不断扩大，所以菌种保藏工作显得更加重要。目的：目的：广泛收集实验室和生产菌种，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于研究、交换、使用的目的。以下是几个国际上规模较大的菌种保藏机构：以下是几个国际上规模较大的菌种保藏机构：美国典型培养物保藏所(ATCC，American Type Culture Collection，Maryland，USA)美国农业部北方地区研究中心（NRRL，Northron Regional Reseach Center Laboratory，Agricultural Resea

17、rch Service. U.S. Department of Agriculture, Peria, Illinois,USA)英联邦国际菌物研究所（CMI）英国国家酵母菌保藏所（NCYC）荷兰菌物菌种中心保藏所（CBS）日本大阪发酵研究所（IFO）中国典型培养物保藏中心(CCTCC，China Center for Type Culture Collection）是中国专利局指定的用于专利程序培养物的保藏机构，成为国内保存专利培养物数量最多，种类最全的保藏机构。中国微生物菌种保藏中心中国微生物菌种保藏中心中心名称中心名称缩写缩写所在地所在地邮码邮码保藏范围保藏范围中国典型培养物保藏中心中国

18、典型培养物保藏中心 普通微生物菌种保藏中心普通微生物菌种保藏中心 农业微生物菌种保藏中心农业微生物菌种保藏中心 工业微生物保藏中心工业微生物保藏中心 医学微生物菌种保藏管理中医学微生物菌种保藏管理中心心 抗生素菌种保藏管理中心抗生素菌种保藏管理中心 兽医微生物菌种保藏中心兽医微生物菌种保藏中心 林业微生物菌种保藏中心林业微生物菌种保藏中心 CCTCC CCGMC ACCC CICC CMCC CACC CVCC CFCC武汉大学武汉大学 中国科学院微生物研究所中国科学院微生物研究所中国科学院病毒研究所中国科学院病毒研究所 中国农业科学院中国农业科学院土壤肥料研究所土壤肥料研究所轻工部食品发酵工业研究所轻工部食品发酵工业研究所中国医学科学院中国医学科学院皮肤病研究所皮肤病研究所中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所中国医学科学院中国医学科学院医药生物技术研究所医药生物技术研究所国家医药管理局国家医药管理局四川抗生素工业研究所四川抗生素工业研究所华北制药厂抗生素研究所华北制药厂抗生素研究所农业部兽医药品监察所农业部兽医药品监察所 中国林业研究所中国林业研究所武汉武汉430072 北京北京100080武汉武汉430071 北京北京100081 北京北京100027 南京南京2100