长效抑制基因表达

1、长效抑制基因表达：GeneEraser shRNA表达载体新产品介绍 GeneEraser shRNA expression systemLong-Term Gene Suppression长期基因抑制 · 有效的基因抑制 · 瞬时和长期的基因沉默研究 · 转染细胞的富集 近年来的研究发现，一些小的双链RNA可以通过促使mRNA降解，高效、特异的阻断体内特定基因表达。称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。由于RNAi可以作为一种简单有效的代替基因敲除的工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域得到了越来越多的重视。为此被Scienc

2、e评为2001年最重要成果之一。RNAi，即引入双链RNA，通过特异性结合互补链从而抑制基因表达/引发转录后沉默。许多的研究人员开始用RNAi作为一种工具研究基因功能。较早的哺乳动物RNAi实验中，siRNAs通过化学方法合成。进一步的，开始有了商业化的体外转录方法合成siRNA的试剂盒提供，比化学合成方法经济。现在已有研究小组开发表达载体，能够在哺乳动物细胞中持续表达siRNAs。Stratagene的新产品GeneEraser shRNA expression vector，可以表达shRNA，在体内加工后形成类似siRNAs的分子，能够引发RNAi过程。   

3、; 小干扰RNA分子(siRNA)已迅速成为一个通过抑制目的基因的表达来研究哺乳动物基因产物功能的强大的工具。通常这些短的，双链RNA分子(shRNA)是由体外产生且价格昂贵。采用Pol III启动子在体内表达短发夹RNA(shRNA)是有效的降低基因表达一个更为经济的方法。Strtagene开发了GeneEraser shRNA表达系统优化了shRNA的表达及基因的抑制。体外合成siRNA的方法尽管非常有效，但其抑制的持久性通常仅有5-7天，使之不能用来进行长期的基因抑制。而用体内表达短发夹RNA的方法，使不能持久抑制基因表达的问题迎刃而解。     

4、shRNA 是怎样工作的？    产生dsRNA分子的另一个有效的方法是在体内表达一个短发夹RNA分子(shRNA)。这种shRNA包含两个由一个小环序列所分离的短反向重复序列，是由Pol III启动子控制的。其中一个反向重复序列与目的基因互补。ShRNA随后被加工成siRNA,降解目的基因mRNA、抑制表达。有效抑制    GeneEraser shRNA 表达系统包括pGE-1载体及合适的对照用来在实验室中建立起系统。我们选择人类的U6启动子以有效的表达 shRNA。该启动子控制下，该系统在多种细胞系中都显示出对荧光素酶(对照)的

5、持久的抑制，其持久的表达水平降低达到80-95%。哺乳动物的选择标记     PGE-1载体采用常见的pCMV-Script 作为骨架，在E.coli中提供了卡那选择标记，在哺乳动物中为新霉素。哺乳动物的选择标记给你的实验带来很多便利，特别当转染效率相当低时。通过挑选包含pGE-1载体的细胞，包含和表达shRNA的细胞数量被富集，可以用来作长期抑制的分析。提供对照    实验室里新建一个系统常常很困难，所以我们提供GeneEraser shRNA expression controls，帮助刚刚投身于siRNA领域的研究者。

6、此试剂盒包括荧光素酶表达质粒(pCMV-luc)，这是一个shRNA载体，表达抑制荧光素酶基因的shRNA(pGE-1-shluc)。另外提供阴性对照，其表达的shRNA与人、小鼠和大鼠的基因组没有任何同源性。 目的序列的选择    基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。以下所述几条对于shRNA设计的成功极为重要。· 选择跟有AA序列的29个碱基，正义链和反义链都采用这29个碱基(不包括AA重复)来设计寡核苷酸。 · 避免在起始密码子或无义

7、区域附近选择目的序列。 · ShRNA序列的GC含量应为40%-50%左右。 · 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。 寡核苷酸的设计· 通常克隆在shRNA表达载体中的shRNA包括两个由一茎环序列分隔的反向重复序列，随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。 · 两个互补的寡核苷酸需带有5BamHI和3XbaI接头。 · Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。 · 在BamHI位点下游紧连一个C使插入片段和启动子有一定空间间隔以确

8、保转录的发生。 · ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。 · ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。如上图所示的茎环序列就包含一个HindIII酶切位点。5TTCG3通常作为茎环序列。而在比较了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3序列最为有效。 · 5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。 ·

9、在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。If the upper strand of the target sequence does not begin with a G nucleotide, a G must be included immediately upstream of the target sequence.Figure 3 shRNA insert design. 产品信息：GeneEraser shRNA expression vector 货号：240090包括: pGE-1 shRNA expression vectorp

10、GE-1-neg control vectorSCS-1 host strainGeneEraser shRNA expression control 货号：240093包括: pGE-1-shluc control vectorpGE-1-neg control vectorpCMV-luc control vectorsiRNA 的设计(之一)如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果，生物通将陆续为你介绍有关siRNA设计的最新资讯。1.从转录本（mRNA）的AUG起始密码 开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siR

11、NA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。    Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。2.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ ） 3.选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个

12、靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。负对照    一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。    如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出

13、端无需和靶序列互补。揭开RNAi上的神秘光环：应用生物发光报告基因优化RNAi不 是所有的siRNA在抑制哺乳动物靶基因时都同样有效，因此找到最有效抑制靶基因表达的siRNA的序列非常重要。     主要的RNAi的功能性介导物是双链、21-23个核苷酸长度的短干扰RNAs (siRNAs)。siRNAs与RNA诱导的沉默复合体（RISC）相互作用，在这里，siRNAs作为识别及剪切互补靶mRNA的模板。合成的siRNAs，或以短发夹RNAs (shRNAs)表达的siRNAs可以被导入细胞并用于RNAi的诱导。并非产生的指向靶基因的siRNA在抑制哺乳

14、动物靶基因时都同样有效，因此，找到最有效抑制靶基因表达的siRNA序列非常重要。新的有效siRNA的设计原则已经被提出（1-3）。目前的筛选技术以半定量，费时的方法为基础，不能简单地用于快速、多个siRNA/shRNA序列的同时筛选。但是，随着RNAi领域的不断进展，并采用了更多的高通量手段，用于确定siRNA效应的快速定量的筛选方法正在被人们所需要。RNAi 所需的方方面面        有效的RNA干扰实验由两个基本步骤组成：1)找到有效的siRNA靶序列和2）在细胞中表达这些靶序列。在下面，我们详细叙述了完全

15、满足这些步骤的三个载体系统。这些系统提供了简单快速的方法。psiCHECKTM载体(p2-6)提供了找到有效的siRNA靶序列的简单快速的方法。siSTRIKE系统(p7-10)可用于快速简单地连接及表达寡聚核苷酸。siLentGene-2载体系统(p11-14)提供了用于检测靶序列的快速盒式方法和将靶序列与载体系统连接的方法。psiCHECK载体的介绍psiCHECK载体提供了用于优化RNA干扰（RNAi）的快速的定量方法。该载体可以通过检测融合报告基因的活性来显示靶基因的表达变化。在psiCHECK载体中海肾荧光素酶作为报告基因。插入的靶基因可以克隆到海肾荧光素酶翻译终止密码子下游的多克隆

16、位点。针对靶基因的RNAi效应的启动导致包括海肾荧光素酶RNA序列在内的融合mRNA的剪切及后续的降解。RNA的降解导致海肾荧光素酶的活性下降。可以检测海肾荧光素酶活性的下降，同时可以用作检测RNAi对靶基因作用的一个方便指标。因此，psiCHECK载体可以用于RNAi活性的定量检测并且可以轻松地用于高通量研究领域。psiCHECK载体可以用于理想的定量选择siRNA靶位点，而且可以用于高通量应用。psiCHECK-1 (C8011)和psiCHECK-2 (C8021)载体都含有合成的海肾荧光素酶(hRluc)报告基因，用以监测RNAi活性。为了有利于靶基因与合成的海肾荧光素酶报告基因的融合

17、，在海肾荧光素酶翻译终止密码子的3端加上了数个内切酶位点（例如：多克隆区域）。这些内切酶位点可以用于感兴趣的基因与海肾荧光素酶报告基因的融合。由于海肾荧光素酶翻译终止密码子的存在，将不会产生非融合蛋白。所以，当插入靶基因时无需保持功能性开放阅读框。另外，还可以用这种设计进行毒性基因或片段的分析。我们推荐用psiCHECK-1载体监测RNAi在活细胞中的活性。海肾荧光素酶活性的变化可以用EnduRen活细胞底物(Cat. E6481)进行测定。这种方法可以连续监测细胞内的生物发光。可以连续2天监测海肾荧光素酶的表达而不会干扰细胞的正常生理状态。psiCHECK-2载体包含第二个报告基因-合成的萤

18、火虫荧光素酶基因(hluc+), 是为终点裂解检测而设计的。海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性可以利用Dual-Luciferase® 报告检测系统(E1910) 或Dual-Glo荧光素酶检测系统(E2920)进行测定。包含了萤火虫荧光素酶报告基因的psiCHECK-2载体使得海肾荧光素酶的表达变化与萤火虫荧光素酶的表达变化标准化，使得该系统的可信度及重现性都得到了提高。psiCHECK载体如何发挥作用？        图1是psiCHECK载体作用机理的基本示意图。将感兴趣的基因克隆到位于合成的海肾荧光

19、素酶基因及其翻译终止密码子3端的多克隆区域。克隆后，将载体转入哺乳动物细胞系，海肾荧光素酶基因与靶基因的融合体得以转录。如果转录本是完整无损的，功能性的海肾荧光素酶即可被翻译。表达shRNA的载体或合成的siRNA可以同时共转化或顺序转化，这取决于你的实验设计。如果特异性的shRNA/siRNA有效地启动作用于靶RNA的RNAi过程，融合的海肾荧光素酶靶基因mRNA序列即被降解，导致海肾荧光素酶的活性下降。图1.psiCHECK载体的作用机理。对psiCHECK载体用途的评价        为了评价这一筛选效应si

20、RNA探针方法的有效性，我们使用位于每个载体多克隆区域的Sgf I 及Not I内切酶位点，将人p53 cDNA克隆到psiCHECK-1和psiCHECK-2载体上。内切酶位点位于海肾荧光素酶翻译终止密码子的3端。我们也同时设计了5个不同的p53基因的shRNA。为确保所构建的含有shRNA的DNA能够针对p53基因的不同靶位点，我们使用了基本型siLentGeneTM -2 U6发夹克隆系统(C1860)。siLentGeneTM -2 U6发夹克隆系统可以使用一步法PCR得到含有U6启动子- shRNA序列（靶序列-环-反互补靶序列）-U6终止序列的DNA盒式结构。 转录的PCR片段可以

21、直接转入哺乳动物细胞，用于有效预筛选shRNA靶序列，避免了费时的克隆步骤。        为了评价上述方法，我们将含有p53 cDNA的psiCHECKTM-2载体与表达p5 shRNA或无关shRNA（图2，点1-5）的线性DNA共转染HEK293T细胞。另外，我们用相对于有海肾荧光素酶完全互补的，或4个错配碱基的shRNA作为阳性对照。萤火虫及海肾荧光素酶信号使用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(E1980)产生。我们通过监测用萤火虫荧光素酶信号校正的海肾荧光素酶活性下降来确定

22、不同的shRNA的效应。为确定从线形DNA表达的shRNA是否表现出同样的抑制作用，我们使用了基本型psiCHECKTM-2载体。我们使用表达针对p53基因不同靶位点的shRNA载体重复实验。图2概括了这些数据。       数据以针对不同靶位点的shRNA产生的海肾荧光素酶活性的（经过校正）抑制百分比表示。与非特异性对照相比，由针对海肾荧光素酶（按照操作手册TB329介绍的PCR方法得到）的线形DNA片段表达的shRNA表现出对校正后的海肾荧光素酶信号有43%的降低，并且通过将错配碱基导入靶序列可以消除这种抑制作用。5种针

23、对p53的shRNA对海肾荧光素酶/ p53均有抑制作用；但是，抑制水平在56%（点2）-74%（点5）之间变动。将线形DNA片段克隆到psiCHECKTM-2基本型载体后，可以观察到相似的抑制作用（兰色柱与红色柱相比）。在两种情况下，点4的p53表现出最高的抑制水平。但是，当用表达shRNA的载体转化细胞时，实际的抑制水平会更高。当psiCHECKTM-2基本型载体表达针对p53靶位点4的shRNA时，可以检测到表达的海肾荧光素酶- p53蛋白有86%的降低。        从这些数据中可以得出一些结论。首先，盒

24、式系统及载体系统均表现出抑制效果。其次，通过PCR方法得到的DNA分子可以直接转化细胞以筛选合适的靶位点。再次，当将shRNA分子克隆到适合的载体（psiCHECKTM-2基本型载体）时，表现出最高的抑制水平,提示理想的RNAi效应来自于较大的DNA载体结构。图2. 使用psiCHECKTM -2载体选择p53基因的靶位点。图A. 将HEK293T细胞接种于96孔板，密度为3,000细胞/孔。利用Sgf I 及Not I内切酶位点，将人p53 cDNA克隆到psiCHECKTM-2载体。分别用每孔0.02g psiCHECK-2载体：p53及每孔0.08g siLentGene-2 U6发夹盒

25、（兰色柱）或基本型psiCHECKTM-2载体（红色柱）转化细胞。CodeBreakersiRNA转化试剂（E5052）用于转化DNA盒结构，TransFast转化试剂（E2431）用于转化载体DNA。针对人p53的5个靶位点的shRNA作为对照。使用了针对海肾荧光素酶完全互补的或4个碱基错配的shRNA。将这些数据与用针对非特异性序列shRNA转化细胞的数据进比较。转化后48小时，使用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(Cat.#E1980)测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。数据以针对不同靶位点的shRNA产生的海肾荧光素酶活性（经过校正）抑制百分比表示。数

26、据为12孔的平均值加减标准差。图B. 用HEK293T细胞测定抑制作用并用Western blot方法进行分析。单独用非特异序列处理细胞（泳道1），用克隆了非特异序列（泳道2）或p53靶位点4的psiCHECK-2基本型载体处理细胞（泳道3）。瞬间检测于72小时后进行。        为了验证上述方法，需要证明表达针对p53靶位点4的shRNA对内源p53蛋白的抑制作用。图2B给出了用表达针对非特异性序列（泳道2）与针对p53靶位点4（泳道3）的psiCHECK-2基本型载体转化HEK293T细胞的Western

27、blot分析结果。分析结果显示，在shRNA处理的细胞中，p53蛋白含量（用-actin校正）的降低超过了80%。，确认了使用psiCHECK载体得到的结果。监测RNAi的动力学        使用psiCHECK载体中的海肾荧光素酶可以实时监测由RNAi介导的海肾荧光素酶在活细胞中的表达。图3显示用含有人p53 cDNA 的psiCHECK-1载体与表达针对海肾荧光素酶或非特异性序列或p53的psiCHECK-2基本型载体共转化的细胞中海肾荧光素酶活性的变化。于转化后17小时向培养孔中加入非裂解EnduRen活细

28、胞底物，监测其后26小时到41小时的相对光强度。我们观察到，在用针对非特异性序列shRNA转化的细胞中，海肾荧光素酶活性显著升高，而用针对海肾荧光素酶或p53靶位点4的shRNA转化的细胞中，海肾荧光素酶的表达只有轻微的升高。在用功能性shRNA转化的细胞中于41小时测到了对肾荧光素酶80%的抑制率。上述结果与图2中用终点分析法得到的抑制结果相一致。实验终了时，加入CellTiter-Glo®荧光细胞存活检测试剂(Cat.#G7570) 以确定细胞的生存状态。当海肾荧光素酶信号用每孔中的活细胞数校正后，抑制水平没有变化，但是，在信号变化方面，孔与孔之间表现出显著的降低（数据未列出）。

29、图3. 活细胞中海肾荧光素酶活性变化的测定。将HEK293T细胞接种于96孔板，密度为3,000细胞/孔。培养过夜后用转化混合物处理细胞。转化混合物的组成为：35l 无血清培养基，0.3l TransFast转化试剂（E2431），每孔0.02g psiCHECK-1载体：p53及每孔0.08g psiLentGene-2基本型载体。本实验中psiLentGene-2基本型载体表达针对p53，海肾荧光素酶或非特异序列（阴性对照）的shRNA。培养1小时后，向每孔加入100l含血清培养基。转化后17小时，加入EnduRenTM活细胞底物(E6481)，使其终浓度为60M，并监测海肾荧光素酶活性。

30、对多个目标筛选多个shRNA        我们分析了由一组caspase基因RNAi引起的沉默效应以确定本系统在鉴定其它基因的有效RNAi位点方面的可用性。我们使用siLentGene-2 U6发夹克隆系统提供的快速PCR方法，得到了shRNA。用针对caspase不同靶位点的PCR产物与含有caspase基因编码cDNA 的psiCHECK-2载体共转化细胞。转化后48小时测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶的活性。柱状数据列于表4。图A，用克隆了caspase-8 cDNA的psiCHECK-2载体及表达针对ca

31、spase-3、caspase-7、caspase-8 及caspase-9的不同靶位点的DNA盒共转化Hela细胞。数据显示，当与psiCHECK-2: caspase-8载体共转化时，只有含有针对caspase-8靶序列的一个shRNA（位点3）表现出对海肾荧光素酶活性明显的抑制作用。针对不同caspase（例如：caspase-3，7或9）靶位点的shRNA对海肾荧光素酶活性未表现出明显的抑制作用。图4。 多个候选shRNA的筛选。图A. 将caspase-8 cDNA克隆到psiCHECK-2基本型载体的多克隆区域作为psiCHECK-2：caspase-8载体。设计3个特异性抑制ca

32、spase-3，caspase-7，caspase-8和caspase-9的候选shRNA。siLentGene-2盒表达的shRNA通过PCR单独获得。用psiCHECK-2：caspase-8载体与针对不同靶位点的siLentGene-2 DNA盒共转化Hela细胞。转化后48小时，用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(Cat.#E1980)测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。海肾荧光素酶相对光强度单位用表达的萤火虫荧光素酶活性校正。图B. 用克隆了caspase-3，7，8 或caspase-9的psiCHECK-2载体与表达针对相应caspase靶位点s

33、hRNA的siLentGene-2盒共转化Hela细胞。转化后48小时，用图A. 所描述的方法测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。数据用抑制百分比表示。非特异shRNA转化细胞中校正后的海肾荧光素酶活性与针对不同caspase和不同靶位点的shRNA转化细胞中校正后的海肾荧光素酶活性的比值即为抑制百分比。    用含有相应caspase（例如caspase-3）cDNA的psiCHECK-2载体与表达针对相同caspase（本例中为caspase-3）多个靶序列shRNA的DNA共转化的数据示于图4，B。数据以抑制海肾荧光素酶活性的百分比来表示，而海肾荧光素酶活

34、性通过转化了非特异性shRNA的细胞中的海肾荧光素酶活性与转化了不同靶位点的shRNA的细胞中的海肾荧光素酶活性的比值来校正。所有检测的caspase-3靶序列均未显示出对海肾荧光素酶活性的明显抑制作用。由DNA片段表达的，对caspase-3，caspase-8 和caspase-9最有效位点表现出46%-64%的抑制作用，但是基于我们以前有关海肾荧光素酶及p53靶位点分析的数据，如果将DNA片段克隆到合适的载体，抑制水平将会有所升高。结 论        为了在鉴定及定量RNAi启动因子（如shRNA或siRN

35、A）方面为研究者提供帮助，Promega公司开发了psiCHECK载体系统。一旦感兴趣的基因被克隆到所选择的psiCHECK载体，就可以利用定量并快速的方法来优化RNA干扰。psiCHECK-1载体与EnduRen活细胞底物一同使用可以连续监测活细胞内显示RNAi的海肾荧光素酶表达的降低。由于包含了萤火虫荧光素酶表达盒，对来自psiCHECK-2载体的海肾荧光素酶表达结果可以进行校正，因此减少了实验及转化中的偏差，得到可信，重复性好的结果。RNAi 技术路线选择及应用近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定

36、基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference， RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。现在越来越多的研究人员开始采用RNAi来研究生物体的基因表达。RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。RNAi研究的一般技术路线是：由上述的路线可以看出，获得高纯度的si

37、RNA产物是进行实验的第一步，而转染的效率则是非常关键的因素。一、siRNA的设计在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。选择siRNA靶位点：从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tusch

38、l等建议在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。序列同源性分析:将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ /BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选

39、择3-5个靶位点来设计siRNA。通常来说，每个目标序列设计34对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。设计阴性对照：一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。此外网上提供免费的siRNA设计工具  二、siRNA的获得1. 化学合成定制siRNA 尽管化学合成siRNA是最贵的方法，但却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作就可以拿到高质量的siRNA。如QIAGEN-Xeragon公司可以

40、根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA（可带标记）。它最适用于的情况是：已经找到最有效的siRNA序列，需要大量siRNA进行研究。QIAGEN还提供siRNA设计合成一体化服务“4-for Silencing siRNA duplexes” ：针对客户给出的一个基因序列，由QIAGEN的专家设计并合成4对siRNA，HPP纯度，保证至少一对抑制效率达到70%以上，如果达不到，免费为客户另行设计合成另外4对siRNA。Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6 x 104 cells

41、 in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturers protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Gre

42、en RT-PCR Kit with primers targeted to lamin 2. 体外转录法合成 siRNA长链dsRNA合成如果研究对象不是哺乳动物细胞，可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象。我们可以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成dsRNAs，成本相对化学合成法而言比较低。目前市场上有很多这样的体外转录试剂盒，像NEB，EPICENTRE都提供类似的试剂盒。特异性siRNA合成多数生物尤其是哺乳动物，siRNA仍是诱导RNAi的最佳选择。以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得

43、到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等的效果。这类方法主要适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，以及化学合成的价格成为障碍时。Epicentre MessageMuter shRNAi Production Kit能高效地合成特异shRNA直接用于转染细胞，详见本刊“Epicentre最新的转录专家”介绍。非特异性siRNA合成特异性制备siRNA的方法的不足，是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒

44、” 就可以避免这个缺陷。这个方法通常选择2001000碱基的靶mRNA模板，用体外转录的方法制备长片断双链dsRN A ，然后用RNase III (或 Dicer)（大肠杆菌RNase III是一种识别双链 RNA的内切酶，产物为 3端外悬2-3个碱基的双链短片段）在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的长链dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，转染方法和特异性siRNA一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。NEB公司的ShortCut RNAi Kit，就是采用此类方法的试剂盒。非特异性siRNA合成，

45、尽管特异性不强，无法确知有效靶片段，但相对经济，基因沉默效率高；可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因沉默。3siRNA表达载体化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这

46、样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到45个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地

47、抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。目前BD CLONTECH公司的RNAi-Ready表达载体就是这样的产品（原理如下图）。同时RNAi-Ready表达载体还能与逆转录病毒和腺病毒表达系统整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性，彻底克服某些细胞转染效率低的障碍，是实现哺乳动物细胞siRNAs瞬时表达与稳定表达的理想

48、工具。Figure 4. Transfected RNAi-Ready pSIREN vectors suppress luciferase expression. Luciferase expression is suppressed in HEK 293 cells containing the functional luciferase siRNA. Panel A. Lysates were run on a 12% polyacrylamide gel, Western blotted, and probed using an anti-luciferase antibody (1:

49、2,000 dilution). Panel B. The same Western blot was probed with an anti-b-actin antibody (1:2,000 dilution) to control for sample loading. Lane 1: circular vector alone. Lane 2: vector containing luciferase siRNA insert. Lane 3: vector containing negative control siRNA insert.最近新推出的带有荧光标记的siRNA表达载体更

50、是广受到研究者的重视与欢迎。因为带荧光标记的表达载体，可以使我们通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率。可通过荧光显微镜观察含有shRNA的细胞或通过流式细胞仪富集被转染的细胞。同时荧光蛋白的表达与shRNA的表达是独立的，因此不影响shRNA基因沉默的效果。下面这个图就是使用BD CLONTECH的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 和 pSIREN-DNR-DsRedExpress Vector转染HEK 293 细胞的结果。 Figure 5. Fluorescent RNAi-Ready pSIREN vectors gene

51、rate effective, tagged shRNA expression cassettes (SECs). Using the BD Knockout RNAi Clone & Confirm PCR Kit, fluorescence-tagged SECs were generated by PCR from ligation mixtures of a negative control () or a luciferase (+) shRNA annealed oligo, and an RNAi-Ready pSIREN vector with a fluorescen

52、t marker. The PCR-generated SECs were subsequently cotransfected with pCMV-Luc into HEK 293 cells. Luciferase activity was measured 48 hours after transfection. Shown are ZsGreen-tagged (Panel A) and DsRedExpress-tagged (Panel B) SECs in cotrans-fected cells. The SECs effectively knock down lucifera

53、se expression by >85% (Panel C).4. siRNA表达框架siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。它能够直接导入细胞进行表达而无需先克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序验证等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不到一天就可完成。因此，SECs是筛选siRNA的最简单有效的工具，可作为构建高效的体内转录载体进行RNAi研究的预实验，对不同宿主细

54、胞优化筛选转录启动子和siRNA靶序列。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。这个方法的主要缺点是PCR产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那可以解决很大问题。另外，不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现，可能会因此导致结果不理想。三、转染细胞由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此如何高效地将siRNAs转入细胞也是成功抑制基因表达的关键步骤。例如，一个siRNA分子对某特定

55、基因的抑制效率为90%，而转染效率为10%，那么最后抑制蛋白表达最后的效率只有9%，可见如何提高siRNAs的转染效率非常重要。目前传统转染方法与转染试剂盒很难达到高效率的siRNAs转染，效果都不理想。QIAGEN公司的RNAiFect是专门的RNAi转染试剂，它的原理基于脂质体技术，适用于多种真核生物细胞，如AGS，HEK-293，HeLaS3，Huh-7，HUVEC，NIH-3T3等等（具体效果见Figure 1）。而且该试剂的细胞毒性很低（Figure 6）。Figure 6. Cells were transfected and LDH activity in the cell cu

56、lture supernatants was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufacturers protocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed by detergent was set to 100%. Background LDH activity was measured in untransfected and untreated cells, and thi

57、s value was subtracted from all other measurements. 对于siRNA表达载体与表达框架等DNA的转染，可以选用常规的DNA转染试剂。四、分析RNAi的效果RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用 RT-PCR，定量PCR，或Northern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可通过Western杂交，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。与传统的基因敲除等基因沉默技术相比，RNAi技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道也日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。不仅如此，RNAi技术还将可能成为研究细胞信号传导通路与基因治疗的新途径。RNA 操作注