不同菌株固态生料混合发酵棉籽粕和菜粕

1、不同菌株固态生料混合发酵棉籽粕和菜粕（1）实验材料基本原料：棉粕，菜粕，玉米培养基原料：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，酵母膏，葡萄糖，琼脂，蒸馏水，酵母浸膏，K2HPO4，柠檬酸氢二铵，无水乙酸钠，Tween80，MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O使用仪器：分光光度计，振荡器（振荡频率120130次/min往复)恒温水浴，具塞三角烧瓶:100,250 mL，容量瓶:25 mL(棕色)，吸量管:1,3,10 mL，移液管:10,50 mL，漏斗:直径50 mm，表玻璃:直径60 mm。检测试剂和药品：异丙醇，正己烷，冰醋酸，苯胺，锌粉，3-氨基-1-丙醇，氯化钯，羧甲基纤维

2、na（2）菌株准备：（3） 培养基的制备牛肉膏蛋白胨培养基( 培养芽孢杆菌) : 牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g( 固体培养基加琼脂18 20 g) ，蒸馏水1 L，pH 7. 0 7. 2，120灭菌30 min。YPD 培养基( 培养酵母菌) : 酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g( 固体培养基加琼脂18 20 g) ，蒸馏水1 L， 120灭菌30min。MRS 培养基( 培养乳酸菌) : 蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸氢二铵2 g，无水乙酸钠5 g，Tween80 1 mL，MgSO4·7

3、H2O 0. 58 g，MnSO4·H2O0. 25 g( 固体培养基加琼脂18 20 g) ，蒸馏水1 L，pH 6. 2 6. 8， 120灭菌30 min。PDA 培养基( 培养黑曲霉) : 将马铃薯去皮切成小块，称取200 g 置于锅中，加水1 L 煮沸约30 min，6 8 层纱布滤成清液，滤液中加入葡萄糖20 g( 固体培养基加琼脂18 20 g) ，补充水分至1 L，加热至融化， 120灭菌30 min。（4） 发酵条件：原料棉籽粕粉碎过40 目筛，将棉粕、菜粕，玉米粉按4 4 2 比例混匀 ，料水比1 0. 8，接种量5%，每组设两个个重复置于500 m l三角瓶中静

4、止培养24h，48 h，72h后取出，于50下烘干，粉碎分析测定。（5） 实验结果和分析a测定硫代葡萄糖苷（下面）b测定棉酚含量（下面）c测定粗蛋白（按照教科书）d测定粗纤维（按照教科书）饲料中游离棉酚的测定方法2 原理在3-氨基一1一丙醇存在下用异丙醉与正己烷的混合溶剂提取游离棉酚，用苯胺使棉酚转化为苯胺棉酚，在最大吸收波长440 nm处进行比色测定。3试剂和溶液除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。3.1 异丙醇C(CH3)2CHOH,HG 3-1167)3.2 正己烷3.3 冰乙酸（GB676）3.4 苯胺 (CsH,NH,GB6 91):如果测定的空白试验吸

5、收值超过0.022时，在苯胺中加入锌粉进行蒸馏弃去开始和最后的10%蒸馏部分，放入棕色的玻璃瓶内贮存在(0-4)冰箱中，该试剂可稳定几个月。3.5 3-氨基-1-丙醇(H2NCH,CH2CH2OH）。3.6 异丙醇-正己烷混合溶剂:6:4(V /V )。3.7 溶 剂A:量取约500m L异丙醇、正己烷混合溶剂(3.6),2mL3-氨基一1一丙醇(3.5),8m L冰乙酸(3.3)和50 mL水于1000 mL的容量瓶中，再用异丙醇一正己烷混合溶剂(3.6)定容至刻度。4 仪器、设备4.1 分光光度计:有10 mm比色池，可在440 nm处测量吸光度4.2振荡器（振荡频率120130次/min

6、往复)。4.3 恒温水浴4.4 具塞三角烧瓶:100,250 mL4.5 容量瓶:25 mL(棕色)4.6 吸量管:1,3,10 mL4.7 移液管:10,50 mL.4.8 漏斗:直径50 mm.4.9 表玻璃:直径60 mm5 试样制备采集具有代表性的棉籽饼样品，至少2kg，四分法缩分至约250g，磨碎过2.8m m孔筛，混匀，装人密闭容器，防止试样变质，低温保存备用。6 测定步骤6.1 称取1-2g试样(精确到。.001 g)>置于250 ml具塞三角烧瓶(4-4)中，加入20粒玻璃珠，用移液管(4.7)准确加入50 mL溶剂A(3.7)，塞紧瓶塞，放入振荡器(4.2)内振荡1 h

7、(每分钟120次左右)。用干燥的定量滤纸过滤，过滤时在漏斗(4.8)上加盖一表玻璃(4.9)以减少溶剂挥发，弃去最初几滴滤液，收集滤液于100 mL具塞三角烧瓶(4.4)中。6.2 用吸量管(4.6)吸取等量双份滤液5-10 mL(每份约含50100 yg的棉酚)分别至两个25mL棕色 容量瓶(4-5)a和b中，如果需要，用溶剂A(3.7)补充至10 mL。6.3 用异丙醇一正己烷混合溶剂(3.6)稀释瓶a至刻度，摇匀，该溶液用作试样测定液的参比溶液。6.4 用移液管(4.7)吸取2份10m L的溶剂A(3.7)分别至两个25m L棕色容量瓶(4.5) a。和b。中。6.5 用异丙醇一正己烷混

8、合溶剂(3.6)补充瓶a。至刻度，摇匀，该溶液用作空白测定液的参比溶液。6.6 加2.0 m L苯胺(3.4)于容量瓶b和中，在沸水浴(4.3)上加热30min显色。6.7 冷却至室温，用异丙醇一正己烷混合溶剂(3.6)定容，摇匀并静置1 h.6.8 用10 mm比色池，在波长440 nm处，用分光光度计(4.1)以a。为参比溶液测定空白测定液b。的吸光度，以a为参比溶液测定试样测定液b的吸光度，从试样测定液的吸光度值中减去空白测定液的吸光度值，得到校正吸光度A。7测定结果7.1计算公式游离棉酚×106式中：X游离棉酚含量（mg/kg）；A校正吸光度；m试样质量（g)V测定用滤液的体

9、积（mL）；a质量吸收系数，游离棉酚为62.5 7.2 结果表示每个 试 样 取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。结果 表 示 到20m g/kg.7.3 重复性同一 分 析 者对同一试样同时或快速连续地进行两次测定，所得结果之间的差值在游 离 棉 酚含量小于500m g/kg时，不得超过平均值的15%;在游 离 棉 酚含量大于500m g/kg而小于750m g/kg时，不得超过75m g/kg;在游 离 棉 酚含量超过750m g/kg时，不得超过平均值的10%分光光度法测定硫代葡萄糖甙1 方法原理加入分散剂羧甲基纤维素钠溶液，硫甙与氯化钯反应生成有色硫甙钯溶胶清液。硫甙含量越高，

10、溶液颜色越深。因此硫甙含量可通过比色定量。2 实验与方法21 试剂与仪器211 试剂8mmolL氯化钯；015 %羧甲基纤维素钠溶液。其它试剂均为分析纯。212 仪器微机化分光光度计，四孔或六孔恒温水浴锅。22 测定步骤准确称取经研碎的油菜籽或菜饼100mg，移入10ml具塞刻度试管中，沸水浴中干蒸10min，加沸蒸馏水68ml，再蒸煮30min。取出冷却后定容至10ml，过滤。取滤液2ml于10ml比色管，加4ml 015 %的羧甲基纤维素钠，摇匀后再加2ml 8m mol1的氯化钯显色溶液，在22±3放置2h，在微机化分光光度计540mm 处用lcm 比色皿，以氯化钯 羧甲基纤维素钠空白溶液作参比溶液，测其消光度.23 标准曲线的制作准确称取100mg，150mg,200mg,250mg,300mg还未发酵样品，根据以上测定步骤进行测定，以样品质量为横坐标，消光度为纵座标作标准曲线(图1)（已知体积一定，样品质重量和硫苷含量