丙种球蛋白与核黄素凝胶层析分离

1、河南大学医学院实验课教案首页实验名称丙种球蛋白与核黄素凝胶层析分离授课对象04级药学2班、05级护理1班教学目标学时分配大体内容与时间安排：(6学时)1. 掌握丙种球蛋白与核黄素凝胶层析分离的原理 讲授时间60分钟2. 学生动手操作 讲授时间60分钟学生操作时间240分钟授课重点1. 层析的基本原理。2. 操作中应注意的事项。授课方法课前准备讲授为主，结合提问、总结，指导纠正，结合学生实验中出现的问题及时指导。教材生物化学实验指导 刘玉庆 主编 人民卫生出版社教研室审查意见主任签字授课教师姓名及职称： 日期：河南大学医学院实验课教案实验名称丙种球蛋白与核黄素凝胶层析分离实验目的1.学习和掌握分

2、子筛凝胶层析法的工作原理和基本操作技术。2学会使用SephadexG50分离核黄素与丙种球蛋白。实验原理在一定的温度下，同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时该物质在这两种介质中的浓度比是一常数称分配系数。不同化学物质的分配系数不同。层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法。其两种介质，一为固定不动，称固定相，另一为可相对流动，称流动相。 层析法已广泛应用在生物化学领域中，无论是少量分析还是大量制备，都能体现出它的高效性，简便性等特点。在实脸室中的常用层析法有：凝胶过滤，纸层析薄层层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析等。 以下介绍几种常用的层析法凝胶过滤 凝胶过滤

3、的别名很多，如凝皎扩散层析，分子筛层析，排阻层析等。这种技术具有操作简便，回收率高(近100)，条件缓和等特点，但它的分离操作速度较慢。该法常用于蛋白质，多糖，核酸的分离纯化。 凝胶过滤的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为VA，它包括填料的骨架体积VGM。，填料的孔体积Vi(内水体积)及填料颗粒间的体积VO(外水体积)。分布在填料的孔中的溶剂是固定相，分布的填料颗粒间的溶剂是流动相。填料颗粒含有许多不同大小的孔如果待分离的物质分子大小合适，则可以不同程度地向孔中扩散，大分子物质只能占有较少的大孔，小分子则能占有大孔及另外一些小孔。所以当不同分子量物质的混合物流经凝胶柱时，较

4、小的分子在柱中停留的时间比大分于停留的时间长，于是混合物中各组分即按分于大小分开，最先流出的是最大的分子。示意图如下所示， 用于生物材料分离的凝胶主要有交联葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex)，聚丙烯酰胺凝胶(商品名为BioGel)，琼脂糖凝胶(商品名Sepharose)等。如常用的交联葡聚糖是将葡聚糖(Dextran)悬浮于有机溶剂，加入交联剂表氯醇交联聚合而成多糖链的三维结构，这种聚合物为白色珠状微粒，是多孔性网状结构，凝胶的孔径大小与交联剂的量有关，交联剂多则交联度大，网状结构紧密，孔径小，反之交联剂少则孔径大。 将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。首先将样品

5、小心自柱顶端加入，洗脱，以分步收集器收集洗脱液，测定每管物质浓度，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵坐标即得如下的洗脱曲线：由图可见最先流出的物质是，A，它的分子量最大，大于该种凝胶的排阻限(A物质分子的直径大于凝胶的孔径)，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，与外水体积VO相等。最后流出的物质是C，它的分子量最小，小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫“全渗入”。流经体积是外水体积VO与内水体积Vi的和。而物质B的分子量介于排阻限与渗入限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中，不能全部地不受限制的通过，这叫做“部分排阻”或“部分渗入”。

6、它的流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即 Ve=VO+KdVi式中Kd称作“排阻系数”或“分配系数”。它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。Kd=(Ve-VO)Vi当Kd=1时，Ve=VO+Vi为全渗入。当Kd=0时，Ve=VO为全排阻。当0Kdt，则说明该物质分子与凝胶有吸附作用。这三种物质的分离过程可见示意图如下： Vi也可通过计算求出：Vi=aWra=凝胶千重Wi=每克干凝胶吸水毫升数Vt=Vo+Vi+VgVg=凝胶骨架体积Vt=可通过测定层析柱内径及高度计算得出：Vt=14D2h下表为交联葡聚糖凝胶的种类和规格：基本操作仪器介绍基本操作：装柱、样品处理、上样、洗脱、分部收集

7、测定设备：层析柱（玻璃柱），铁架台实验步骤1取直径081.2cm，长度为25cm的层析柱，在上口箍橡皮筋，出口处装上乳胶管，柱内加注蒸馏水23ml，排出乳胶管内的气泡，抬高乳胶管防止柱内的蒸馏水排空。自顶部缓缓加入经膨胀的葡聚糖G-50悬液。待底部凝胶沉积23cm时将乳胶管放低，仍继续加入上述悬液至凝胶层积至18cm高度即可。操作过程中，应防止气泡与分层现象的发生。让凝胶自然下沉，使表层平整。待凝胶柱层稳定后，以洗脱液(蒸馏水)洗柱5分钟，调节流速至4滴每分钟。 2. 待蒸馏水流至柱面平时，(注意，不可使柱面干掉)，马上沿层析柱内壁小心加4滴样品于柱床面，注意尽量不使床面搅动，马上加入12倍于样晶体积的蒸馏水，反复两次后，可加大量蒸馏水连续洗脱，这样可以使样品稀释最小。 3样品一旦加入后马上用量筒或刻度离心管收集流出液，柱床上不断加蒸馏水，待红色(血红蛋白)流出一半时记录毫升数，此为血红蛋白Ve也为Vo。继续收集流出液，待黄色(核黄素)流出一半时记录体积，此为核黄素Ve。 4测出柱床体积(Vt)，外水体积(Vo)内水体积(Vi)，及核黄素的洗脱体积(Ve)。并计算出Hb及鱼精蛋的分配系数(Kd)。 5用蒸馏水反复加在柱床上面，洗柱10分钟然后将柱内凝胶回收入凝胶瓶内。注意事项1在收集过程中，要保持流出液的流速稳定，洗脱速度控制在4滴/min。2加样时，保持