Western blot实验步骤

1、Western blot实验步骤SDS-PAGE1. 做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的玻璃板、梳子和制胶架。2)检查是否有新鲜的、足量10%APS，没有就立刻重配。3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。（一般使用12%和7.5%）4)提前一天配制好转印缓冲液，4预冷过夜2. 制胶，电泳1）装置胶架a玻璃板凹面朝里，底部对齐至于架子上。b按正确方向安上楔子，先不压紧。c将两侧边扣扣紧。d双手同时均匀用力，分别将两侧楔子向下压紧。e检查是否密封。2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，总量： 7.5ml)7.51012%15%H2O7.

2、5ml6ml5ml3.5ml1.5MTris-HCL(pH=8.8 )3.75ml3.75ml3.75ml3.75ml10%SDS150l150l150l150l10%APS75l75l75l75lTEMED7.5l7.5l7.5l7.5l30%Acry/bis3.75ml5ml6ml7.5ml分离蛋白大小（kD）36-9420-8012-6010-43在分离胶上缓慢加入一层蒸馏水（约1ml），压平分离胶，并促进胶更好的凝固。 3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，总量：5ml)4H2O3.6ml1MTris-HCL(pH=6.8 )600l10%SDS50l10%APS25lTEME

3、D5l30%Acry/bis670l浓缩胶加完后迅速插入预先准备好的梳子，室温待其凝固。4)制备蛋白样。5×上样缓冲液与样品混合，使上样缓冲液达到1倍浓度，100金属浴或隔水煮8-10min，10000r/min离心5min5)待胶凝固好后，放入电泳槽中，加入电泳缓冲液没过凝胶，6）垂直拔去梳子，上样，电泳。浓缩胶使用140V电压，约20-30min样品电泳至交界面，调电压至110V，继续电泳约1.5h。3、考马氏亮蓝染胶1）铲下弃去浓缩胶，小心剥下分离胶置于大平皿，倒入考马氏亮蓝染色液（覆盖胶即可）2）摇床染色50min3）回收考马氏亮蓝染色液，脱色液摇床脱色30min4）弃去脱色

4、液，用新鲜脱色液摇床脱色30min（可根据情况增加脱色次数）注意：考染和转印应为不同的两块胶。电转移（转印）1 实验条件的选择本电泳仪自动默认转印电流为200mA。按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，一般转印时间为100min，具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度电转移时间(h)80-1408%25-8010%1.515-4012%0.75<2015%0.52 实验操作 （1）滤纸和膜的准备 (提前准备)。A. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。B. 将合适的靠胶滤纸、靠膜滤纸、NC膜、海绵分别泡入转印缓冲液中，4过夜。 （2）转移A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。

5、一般用3层。B. 将胶剥出，去掉浓缩胶，小心的移到靠胶滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡。C. 将膜铺在胶上，注意和胶间不要有气泡，再倒少许转印缓冲液到膜上，保持膜的湿润。剪去膜的左上角，作为标记。D. 将一张靠膜滤纸覆盖在胶上。 倒上些转印缓冲液，再铺3层靠膜滤纸。E. 按照负极-海绵-靠胶滤纸-胶-膜-靠膜滤纸-海绵-正极的顺序放入电泳槽。（NC膜滤纸胶）F. 装好电转移仪，将电泳槽置于盛满冰的冰桶中，确保电泳槽全部被冰覆盖。G. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整（电压一般30-40V,功率6-8W）。 （3）丽春红染膜 A 500l丽春红+4.5ml蒸馏水配制染色液 B 将

6、膜浸泡其中，作用1-2min可见条带。 C 用铅笔标出泳道和maker条带大小。 D PBS洗去丽春红染液。抗原抗体反应1、封闭在转移结束前配好5%的脱脂牛奶(TBST溶解)。转移结束后将膜放入脱脂奶中封闭(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)， 4封闭过夜或者室温封闭2h-4h。3、洗膜 用TBST先快速洗涤，5min×2。2、孵育一抗A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。配制5%的脱脂奶(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。B. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用4过夜或者室温1-2h，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。3、洗膜 用 TB

7、ST先快速洗涤，把脱脂奶尽快的洗掉。然后5min×5。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。4、孵育二抗室温孵育1h。采用HRP标记的二抗，稀释比例1:5000-10000二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗。5、洗膜用 TBST先快速洗涤，把脱脂奶尽快的洗掉。 然后5min×5。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。6、显色（HRP酶）增强化学发光法(ECL)1）将两种显色底物A和B,1：1等体积混合。2）将保鲜膜铺在实验桌上，将NC膜平铺于保鲜膜上，染色液覆盖在膜表面，作用1-2分钟。3）用另一张保鲜膜把NC膜包起来，放入暗盒中，用胶带固定。4）A：在暗室中将X光片折角作为标记，置于膜的上面，盖好暗盒，进行压片曝光，曝光时间根据实际情况而定，一般设定30s，1min，5min，10min等，根据条带深浅程度调整曝光时间。B：取四张胶片相叠，同时放入暗盒中，压片过夜（6h以上）。5）显影30s-1min，定影30s-1min。（根据实际情况定时间）6）胶片冲洗干净后，悬挂晾干后标记。注意：荧光在一段时间后会越来越弱；未干的胶片容易被刮花。DAB显色1）配制DAB