VL7055培养基配方

1、培养基配方一、R2A/R3A培养基配方（g/L）： R2A R3A酵母粉 0.5 g 1.0 g胰蛋白胨 0.5 g 1.0 g酪蛋白氨基酸（casamino acid） 0.5 g 1.0 g葡萄糖 0.5 g 1.0 g可溶性淀粉 0.5 g 1.0 g磷酸氢二钾 0.3 g 0.6 g七水硫酸镁 0.05 g 0.1g丙酮酸钠 0.3 g 0.5g琼脂 15.0 g 15.0 g用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾调pH到7.2后，加1L蒸馏水，搅拌溶解，121灭菌15min。 特点： R2A培养基主要用于水的菌落计数，它可以修复被氯气损伤的细菌，支持耐受氯气的微生物的生长。培养要求，低温（20-3

2、0）长时间培养（5-7天）这样得到的菌落数比常规菌落总数检测的菌落数更符合实际。R3A培养基主要用于菌株的生化特征描述和鉴定。参考文献：Reasoner DJ, Geldreich EE. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol. 1985,49(1):1-7.二、VL55培养基(Sait M et al,2002)（土壤筛菌）配方（g/L） 1 22-(N-吗啉基)乙磺酸 1.95 g 3.9 gMgSO4 0.024 g（0.

3、2mM） 0.048 g（0.4mM）CaCl2 0.033294 g（0.3mM） 0.066588 g（0.6mM）(NH4)2HPO4 0.026421 g（0.2mM） 0.052824 g（0.4mM）亚硒酸盐/钨酸盐溶液 1mL 2mL微量溶液SL10 1mL 2mL用0.2mol/L的NaOH和0.1mol/L的KOH混合液调pH到5.5（这与土壤的pH一致）Sait M等取2的培养基121灭菌15min后，冷却至56，加入10mL5%（w/v）的木聚糖溶液，2mL的维生素溶液1，6mL的维生素溶液2。当量3%洗过的琼脂121灭菌15min后，冷却至56，与前面培养基混匀后倒平板

4、（Widdel F et al.,1992）。备注：亚硒酸盐/钨酸盐溶液（g/L）：NaOH 0.5 g，Na2SeO35H20 3mg，Na2WO42H20 4mg，dd H20 1L，溶解混匀，过滤除菌，4备用。（Tschech and Pfennig, 1984）微量溶液SL7（g/L）：25%HCl 10mL，FeCl24H2O 1.5g，CoCl26H2O 0.19g，MnCl44H2O 0.1g，ZnCl2 0.07g，H3BO3 0.062g，Na2MoO42H2O 0.036g，NiCl26H2O 0.024g，CuCl22H2O 0.017g，dd H20 1L，溶解混匀，过

5、滤除菌，4备用。（Widdel F et al.,1981）微量溶液SL10（g/L）：25%HCl 10mL，FeCl24H2O 1.5g，CoCl26H2O 0.19g，MnCl44H2O 0.1g，ZnCl2 0.07g，H3BO3 0.006g，Na2MoO42H2O 0.036g，NiCl26H2O 0.024g，CuCl22H2O 0.002g，dd H20 1L，溶解混匀，过滤除菌，4备用。（Widdel F et al.,1983）维生素溶液1（mg/L）：维生素B-x（对氨基苯甲酸）40mg，维生素B7（生物素）10mg，维生素B3（烟酸）100mg，维生素B5（泛酸）50m

6、g，维生素B6（吡哆醇类）150mg，维生素B1（硫胺）100mg，维生素B12（钴胺素）50mg，dd H20 1L，溶解混匀，过滤除菌，4备用。（Janssen PH et al.,1997）维生素溶液2（mg/L）：DL-6,8-thioctic acid（硫辛酸）10mg，维生素B2（核黄素）10mg，维生素B9（叶酸）4mg，溶解混匀，过滤除菌，4备用。（Janssen PH et al.,1997）参考文献：Sait M, Hugenholtz P, Janssen PH. Cultivation of globally distributed soil bacteria from

7、 phylogenetic lineages previously only detected in cultivation-independent surveys. Environ Microbiol. 2002,4(11):654-666.Widdel F, Pfennig N. Studies on dissimilatory sulfate-reducing bacteria that decompose fatty acids. I.Isolation of new sulfate-reducing bacteria enriched with acetate from saline

8、 environments. Description of Desulfobacter postgatei gen. nov.,sp.nov.Arch Microbiol. 1981,129(5):395-400.Widdel F, Kohring G, Mayer F. Studies on dissimilatory sulfate-reducing bacteria that decompose fatty acids. III. Characterization of the Filamentous Gliding Desulfonema limicola gen. nov. sp.

9、nov.,and Desulfonema magnum sp. nov.Arch Microbiol.1983,134(4):286- 294.Andreas Tschech, Norbert Pfennig. Growth yield increase linked to caffeate reduction in Acetobacterium woodii. Arch Microbiol .1984,137(2):163-167.Janssen PH, Schuhmann A, Mrschel E, Rainey FA. Novel anaerobic ultramicrobacteria

10、 belonging to the Verrucomicrobiales lineage of bacterial descent isolated by dilution culture from anoxic rice paddy soil. Appl Environ Microbiol. 1997 ,63(4):1382-1388.Widdel F, Bak F. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria. In The Prokaryotes, 2nd edn. Balows A., Trper H.G., Dworkin M

11、., Harder W., Schleifer K.H. (eds). New York: Springer-Verlag, 1992,pp. 33523378.三、改良的VL55培养基（土壤筛菌）（Davis KE et al.,2005）修改的VL55培养基：凝固剂分琼脂和结冷胶两种；用等量的KH2PO4代替(NH4)2HPO4；（Joseph SJ et al.,2002）修改的VL55培养基+gellan/琼脂+不同生长底物（Davis KE et al.,2005）生长底物1：N-乙酰葡萄糖胺 2mM；（Joseph SJ et al.,2002） 生长底物2：葡萄糖，半乳糖，木糖，

12、阿拉伯糖混合物，每种各0.5mM；（Joseph SJ et al.,2002）生长底物3：半乳糖醛酸酯；葡萄糖醛酸酯；抗坏血酸；葡糖酸盐，每种各0.5mM；（Joseph SJ et al.,2002）生长底物4：乙酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，甲醇，每种各0.5mM；（Joseph SJ et al.,2002）生长底物5：氨基酸混合物：每1L原液再加0.8g色氨酸，完全溶解后混匀，取10mL混合液加入1L培养基。（Davis KE et al.,2005）氨基酸混合物（g/L）:天冬氨酸 4.7g，苏氨酸 2.1g，丝氨酸 3.2g，谷氨酸 9.6g，脯氨酸 6.9g，甘氨酸 1.5g，丙氨酸

13、 2g，缬氨酸 2.2g，甲硫氨酸 0.9g，异亮氨酸 1.1g，亮氨酸 2.5g，酪氨酸0.7g，苯丙氨酸 1.4g，赖氨酸 3.5g，组氨酸 1g，精氨酸1.5g。（Hudson J. A. et al.,1989）其他生长底物（w/v）：藻酸钠；黄原胶；果胶；木聚糖；羟甲基纤维素，每种各0.05%；其他培养基修改的VL55培养基+gellan/琼脂+木聚糖0.05%（w/v）/10mM葡萄糖稀释的营养肉汤培养基：0.08g营养肉汤+15g琼脂/8g gellan+0.066588g CaCl2+1L ddH2O，pH6.0。（Janssen PH et al.,2002）营养肉汤培养基：

14、8g营养肉汤+15g琼脂+1L ddH2O，pH6.0Cold- extracted soil extract agar (CSEA)：自然风干的土壤与自来水1：1混匀充分震荡，5000g离心20min，用0.22m滤膜过滤备用。取400mL滤液，600mL自来水，1mL磷酸缓冲液原液，1mL营养原液（分为多成分和单一成分两种），琼脂20g。（Olsen R. A et al.,1987） 磷酸缓冲液原液：64g KH2PO4，36g Na2HPO4，1L ddH2O（pH7.0），用0.22m滤膜过滤除菌备用。营养原液：10g柠檬酸钠，10g琥珀酸钠，10g葡萄糖，10g果糖，10g木糖，1

15、0g蛋白胨，10g酵母粉，用H2SO4调pH7.0后，用0.22m滤膜过滤除菌备用。Winogradskys salt-solution agar (WSA)：取400mL ddH2O，600mL Winogradskys salt-solution，0.1g NH4NO3，琼脂20g。（Olsen R. A et al.,1987）10-fold-diluted tryptone soy agar (0.1 TSA)结果表明：生长底物为木聚糖的实验效果最好！Joseph SJ, Hugenholtz P, Sangwan P, Osborne CA, Janssen PH. Laborato

16、ry cultivation of widespread and previously uncultured soil bacteria. Appl Environ Microbiol. 2003,69(12):7210-7215.Davis KE, Joseph SJ, Janssen PH. Effects of growth medium, inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil bacteria. Appl Environ Microbiol. 2005,71(2):826-83

17、4.Hudson J. A., K. M. Schoeld H. W. Morgan, R. M. Daniel. Thermonema lapsum gen. nov., sp. nov., a thermophilic gliding bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 1989,39(4):485487.Janssen PH, Yates PS, Grinton BE, Taylor PM, Sait M. Improved culturability of soil bacteria and isolation in pure culture of

18、novel members of the divisions Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria, and Verrucomicrobia. Appl Environ Microbiol. 2002 ,68(5):2391-2396.Olsen R. A., L. R. Bakken. Viability of soil bacteria: optimization of plate-counting technique and comparison between total counts and plate counts within

19、 different size groups. Microb Ecol. 1987,13(1):5974.四、基础盐培养基（Stott MB et al.,2008）这篇文章用到的培养基：R2A培养基,pH5.00.5R2A培养基, pH4.5-6.9,同时，加入2g/L MgCl26H2O，用gellan代替琼脂。基础盐培养基：基础盐培养基FS1（g/L）：0.2g NH4Cl，0.05g KH2PO4，0.02g MgSO47H2O，0.01 g CaCl26H2O；0.01g 酵母粉（配成溶液，过滤除菌）；3mL的FeEDTA溶液；3mL的微量元素溶液1；1mL的微量元素溶液2；（1）再

20、加22g琼脂，pH5.5（2）再加15g gellan，1g MgCl26H2O，pH4.5再加入0.1g维生素混合物（培养基FS1V）。FeEDTA溶液（g/L）：1.54 g FeSO47H2O，2.06 g Na2EDTA。微量元素溶液1（g/L）：0.44 g ZnSO47H2O; 0.20 g CuSO45H2O; 0.19 g MnCl4H2O; 0.06 g Na MoO 2H O; 0.10 g H BO ; 0.08 g CoCl 6H O.微量元素溶液2（g/L）：1.5g 氨基三乙酸，0.2g Fe(NH4)2(SO4)26H2O，0.2g Na2SeO3，0.1g Co

21、Cl26H2O，0.1g MnSO42H2O，0.1g Na2MoO42H2O，0.1gNa2WO42H2O，0.1g ZnSO47H2O，0.04g AlCl36H2O，0.025g NiCl26H2O，0.01g H3BO3，0.01g CuSO45H2O（pH 7）100mg维生素混合物：维生素B9（叶酸）0.8mg，维生素B1（硫胺）8mg，维生素B2（核黄素）4mg，维生素B3（烟酸）1mg，维生素B5（泛酸）15mg，烟酰胺10mg，维生素B6（吡哆醇类）15mg，维生素B12（钴胺素）5mg，维生素B7（生物素）5mg，胆碱15 mg，维生素B-x（对氨基苯甲酸）7mg，维生素B

22、-h（肌醇）15 mg。Stott MB, Crowe MA, Mountain BW, Smirnova AV, Hou S, Alam M, Dunfield PF. Isolation of novel bacteria, including a candidate division, from geothermal soils in New Zealand. Environ Microbiol. 2008 ,10(8):2030-2041.VL70培养基(Sait M et al,2002)（土壤筛菌）配方（g/L） 1 23-(N-吗啉基)丙磺酸 1.95 g 3.9 gMgSO4

23、0.024 g（0.2mM） 0.048 g（0.4mM）CaCl2 0.033294 g（0.3mM） 0.066588 g（0.6mM）(NH4)2HPO4 /KH2PO4 0.026421 g（0.2mM） 0.052824 g（0.4mM）亚硒酸盐/钨酸盐溶液 1mL 2mL微量溶液SL10 1mL 2mL用0.2mol/L的NaOH和0.1mol/L的KOH混合液调pH到5.5（这与土壤的pH一致）Sait M等取2的培养基121灭菌15min后，冷却至56，加入10mL5%（w/v）的木聚糖溶液，2mL的维生素溶液1，6mL的维生素溶液2。当量3%洗过的琼脂121灭菌15min后，冷却至56，与前面培养基混匀后倒平板（Widdel F et al.,1992）。备注：亚硒酸盐/钨酸盐溶