不同艾灸时间对类风湿关节炎大鼠TRPV3离子通道蛋白及滑膜细胞凋亡的影响

1、不同艾灸时间对类风湿关节炎大鼠TRPV3离子通道蛋白及滑膜细胞凋亡的影响Hu Zhi-min (胡枝敏),Cao Jiang-peng (曹江鹏),He Lu (何璐), Zhang Hui (张慧), Fu Guang-jian (付广建),Miao Ying (苗影),Yu Ting-ting (于婷婷), Yang Wan-ting (杨婉婷), Song Xiao-ge(宋小鸽) 【摘要】目的：观察不同艾灸时间对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)大鼠瞬时感受器电位香草酸受体3(transient receptor potential vanilloid

2、3, TRPV3) 离子通道蛋白及滑膜细胞凋亡的影响，为艾灸抗炎的作用机制提供新的依据。方法： 将50只Sprague-Dawley (SD)大鼠按完全随机化分组法分为正常组、模型组、灸组、灸组和灸组，每组10只。正常组常规饲养，模型组造模成功后进行常规饲养，灸组、灸组、灸组造模成功后于“足三里”“肾俞”二穴连续艾灸15 d，1次/d，每次艾灸时间分别为5 min、20 min和30 min。观察并记录各组大鼠足跖肿胀度，采取免疫组化法检测背根神经节、脊髓背角TRPV3离子通道蛋白表达情况，运用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl

3、transferase-mediated nick end labeling, TUNEL)检测滑膜组织细胞凋亡数。结果：治疗结束后, 灸组、灸组大鼠趾围与模型组相比显著减小(P<0.05)。模型组背根神经节、脊髓背角TRPV3离子通道蛋白表达均大于正常组(P<0.05); 灸组、灸组背根神经节、脊髓背角TRPV3离子通道蛋白表达均大于灸组(P<0.05)。模型组滑膜细胞凋亡数大于正常组(P<0.05)，灸组、灸组滑膜细胞凋亡数显著大于模型组(P<0.05)。结论：灸治适量时间可引发TRPV3表达，利于促进滑膜细胞凋亡。【关键词】灸法; 艾条灸; 关节炎, 类风湿

4、; TRPV3蛋白, 大鼠【中图分类号】R2-03 【文献标志码】A研究表明, 艾灸治疗 RA 具有确切的抗炎消肿作用,艾灸疗效的产生可能与其温热效应有很大关系1。瞬时感受器电位香草酸受体3(transient receptor potential vanilloid 3, TRPV3)是 TRPV家族中的一员，是主要感受温热(3239)刺激的非选择性阳离子通道。该蛋白通道表达于感觉神经细胞和皮肤角化细胞，在中枢神经系统和感觉神经元，如背根神经节、三叉神经节和脑中可以表达2。TRPV参与多种生理活动的调节，其中包括钙平衡、细胞分化及细胞凋亡等3。为探讨艾灸抗炎的作用机制，本实验对类风湿性关节炎

5、(rheumatoid arthritis, RA)大鼠进行不同时间的艾灸治疗，观察RA大鼠滑膜细胞凋亡及背根神经节TRPV3离子通道蛋白的表达情况，以为艾灸抗炎的作用机制提供新的依据，促进灸法的临床应用。1 材料1.1 实验动物 清洁级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠50只，月龄3月，体重(200±20) g，由安徽省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(皖)2011-002。大鼠于室温(22±2),相对湿度50%70%的环境中适应性喂养 1星期。1.2 药盒与试剂弗氏完全佐剂 (规格10 mL，批号: 068 K8761，Sigma公司，美国)；TRPV3

6、试剂盒（批号: 990563W，北京博奥森生物技术有限公司，中国），二抗试剂盒（批号: K136830B，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国），DAB显色剂（批号: K136821F，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）；特制香烟型纯艾条(直径1 cm，批号: 061205，南阳市卧龙汉医艾绒厂，中国) 。1.3 主要器材RM2135切片机(Leica公司，德国)；BX51光学显微镜(Olympus公司，日本)；JEdA801D形态学分析软件(江苏省捷达科技发展有限公司，中国)。2 方法2.1 模型复制将大鼠放置在温度为(4±2)，湿度80%-90%的环境中，每天12 h，连续20

7、d 。第21 天给每只大鼠右后足趾部注射完全弗氏佐剂 0.15 mL致炎，建立 RA 模型。连续观察 3 d，以 24 h 内出现足踝部急性炎性反应肿胀，48 h 内出现继发性全身多发性关节炎(表现为前肢或对侧肢体,甚至耳、尾部红肿或炎性结节出现)，表明造模成功。2.2 实验分组实验前将动物按完全随机化分组法分为5组，分别为正常组、模型组、灸组、灸组、灸组，每组10只。正常组：不进行造模，常规饲养，连续38 d。模型组：RA模型成功后，大鼠常规饲养，连续15 d。灸组：RA模型成功后，大鼠常规饲养。连续艾灸15 d，1次/d，5 min/次。灸组：RA模型成功后，大鼠常规饲养。连续艾灸15 d

8、，1次/d， 20 min/次。灸组：RA模型成功后，大鼠常规饲养，连续艾灸15 d，1次/d， 30 min/次。艾灸方法：根据文献进行大鼠穴位定位4，选取双侧足三里、肾俞，剪去艾灸、组大鼠各穴区被毛，用特制香烟型纯艾条距穴 2cm 处悬灸，“足三里”、“肾俞”两穴隔天交替艾灸。2.3 观察项目及检测方法2.3.1 大鼠跖围测定分别在致炎前1 d、致炎2 d、治疗1星期和治疗2星期后测量大鼠跖围，共测量4次。测量者将细线一端打结固定，另外一端从大鼠第一、第二足趾间穿过,经足掌中部绕大鼠右后跖一周，确定细线两端相交的位置并固定，拉直细线，通过毫米刻度尺测量细线长度即为大鼠跖围5。2.3.2 滑

9、膜组织细胞凋亡检测实验结束后用20%氨基甲酸乙酯（7 mL/kg·bw）腹腔注射麻醉大鼠。沿大鼠后肢正中纵行切开皮肤，用组织镊与刀片于踝关节下方约 0.5 cm 处纵行切开关节囊，可见髌骨下及向下延续有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，分离关节囊的纤维层和滑膜层，完全剥离滑膜组织，最后以眼科镊轻轻夹住其边缘，用眼科剪完整剪下滑膜组织，取下的组织置于10%福尔马林溶液中冷藏保存。运用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase-mediated nick end labeling, TUNEL)，经石蜡包埋、脱

10、蜡、水合、显色等步骤检测滑膜组织细胞凋亡数。显微镜下观察大鼠滑膜组织切片并摄像，每组选取8-10张切片，每张切片选取 3-5个视野，结果取平均值。JEDA-801D形态学分析软件测定各组大鼠滑膜凋亡细胞的总数。2.3.3 TRPV3离子通道蛋白表达测定滑膜组织取材结束后。将大鼠固定于灌注台上，从心尖处插入灌注针头，快速滴注200 mL生理盐水并剪断下腔静脉，待流出液基本无色，大鼠肝肺颜色变白；换4%多聚甲醛内固定液先快后慢灌注，灌注过程中可观察到大鼠肢体伸展、振颤并逐渐僵硬，待振颤消失后转为慢灌，直至大鼠全身肌肉僵硬。切开背部皮肤，分离脊柱两侧肌肉，暴露脊柱。从T12棘突下与L4棘突下截断脊柱

11、，取出脊髓，沿矢状面打开椎管，取出背根神经节。将组织置于10%福尔马林溶液中冷藏保存待测。运用免疫组化法检测大鼠T12-L4右侧背根神经节、双侧脊髓背角TRPV3表达。免疫组化操作步骤：石蜡包埋做滑膜组织切片，切片脱蜡至水。切片连同染色架放入盛有500 mL柠檬酸的烧杯中，98 保持15 min。在切片上滴加3% H2O2，室温孵育8 min。PBS冲洗3 min×3，加一抗（一抗用PBS稀释，比例为1:150），37 孵育90 min。PBS冲洗3 min×3，加二抗，37 孵育30 min。PBS冲洗3 min×3，甩干，显色，冲洗DAB 10 min。苏木素

12、染色3 min，冲洗；过1%HCL，冲洗；温水蓝化，冲洗；过无水乙醇3 min×3，苯酚-二甲苯3 min，二甲苯3 min×3。最后中性树胶封片。显微镜下观察大鼠背根神经节及脊髓切片，每组选取8-10张切片，每张切片选取 3-5个视野，结果取平均值形态学分析软件测定免疫反应阳性产物的平均光密度值。2.4 统计处理 Excel建表，所有数据用SPSS 17.0统计软件处理。计量资料数据以均数±标准差(±s) 表示, 采用重复测量方差分析和单因素方差分析，各组间均数的两两比较采用One-way ANOVA (least significant differ

13、ence, LSD) 法, 以P0.05为差异有统计学意义。3 结果造模过程中受环境因素的影响，死亡大鼠4只（灸组2只，灸组2只）。由于该实验大鼠均为雄性，易发生激烈的争斗，导致正常组大鼠死亡2只。实验结束后各组大鼠的数目为正常组8只、模型组10只、灸组10只、灸组8只、灸组8只。3.1 艾灸对RA大鼠足跖肿胀的影响 造模前各组间大鼠跖围比较，差异无统计学意义(P0.05)。致炎后，各造模大鼠足跖跖围较正常组明显增粗,差异有统计学意义(P0.05)。致炎2 d是肿胀的高峰期，各造模大鼠足跖与踝部呈急性炎症性红肿，造模各组间跖围无统计学差异(P0.05)，表明模型复制成功（图1）。经艾灸治疗一星

14、期后，灸组、灸组大鼠跖围有下降趋势，与同期模型组相比差异均有统计学意义(P0.05)；正常组大鼠趾围远小于模型组大鼠趾围，差异有统计学意义(P0.05)。经艾灸治疗2星期后，灸组、灸组大鼠跖围下降明显，与同期模型组相比差异均有统计学意义(P0.05)。灸组大鼠趾围显著低于同期灸组大鼠趾围，组间差异有统计学意义(P0.05)，灸组、灸组大鼠趾围差异无统计学意义(P0.05)。提示艾灸20 min、30 min对RA大鼠局部肿胀有明显的改善作用(表1）。表1. 各组大鼠右足跖肿胀度(跖围)比较 (±s, cm)组别n致炎前1d致炎2 d后治疗1星期后治疗2星期后正常组82.92±

15、;0.112.91±0.102.92±0.112.95±0.09模型组102.68±0.283.85±0.281)3.74±0.251)3.61±0.151)灸组102.71±0.223.88±0.271)3.62±0.131)3.58±0.171)灸组82.67±0.133.87±0.251)3.51±0.201)2)3.28±0.161)2) 3)灸组82.68±0.353.90±0.261)3.50±0.161

16、)2)3.38±0.151)2) 3)注：与正常组比较，1) P0.05；与模型组比较，2)P0.05；与灸组比较，3)P0.05 3.2 不同艾灸时间对滑膜组织细胞凋亡的影响 正常组滑膜光滑，无增生现象；模型组滑膜增生，细胞凋亡数不足，滑膜明显增厚；灸组、灸组较灸组滑膜增生明显，细胞凋亡数明显增多（图2）。正常组的细胞凋亡数明显少于模型组细胞凋亡数，组间差异有统计学意义(P0.05)。灸组、灸组和灸组的细胞凋亡数显著增高，与模型组相比差异有统计学意义(P0.05)。与灸组、灸组比较，灸组细胞凋亡不足，组间差异有统计学意义(P0.05)。灸组与灸组差异无统计学意义(P0.05)。由此

17、可见艾灸治疗对RA大鼠关节炎症均有治疗作用，艾灸20 min、30 min促进滑膜细胞凋亡的作用较明显(表2）。 表2. 各组大鼠滑膜组织细胞凋亡阳性细胞数(±s)组别n细胞凋亡数正常组879.50±26.41模型组10170.50±46.191)灸组10287.50±73.281)2)灸组8730.13±182.241)2)灸组8631.63±195.911)2)3)注：与正常组比较, 1) P0.05; 与模型组比较, 2) P0.05;与灸组比较, 3) P0.053.3 不同艾灸时间对背根神经节和脊髓背角TRPV3表达的影响

18、在背根神经节，与模型组比较，灸组的TRPV3表达量显著增高，差异有统计学意义（P0.05）；模型组TRPV3表达量高于正常组TRPV3表达量，但组间差异无统计学意义(P0.05)；与灸组比较，灸组TRPV3表达量增加，组间差异有统计学意义（P0.05）；灸组比灸组TRPV3表达量减少，但无差异（表3）。在脊髓背角，与模型组比较，灸组、灸组和灸组的TRPV3表达量均增高，差异有统计学意义（P0.05）；模型组TRPV3表达量高于正常组，但差异不显著；与灸组比较，灸组的TRPV3表达量较高，差异有统计学意义（P0.05）；灸组TRPV3离子通道蛋白表达量虽少于灸组，但是组间差异无统计学意义(P0.

19、05)。由此可见，艾灸20min、30min后脊髓背角细胞TRPV3表达量较高（表3）。TRPV3在脊髓背角细胞胞膜、胞浆中均有表达，不同组别染色程度有差异。正常组TRPV3染色浅；模型组有少数细胞染色深；灸组有少数细胞染色深且集中；灸组、灸组TRPV3多数细胞染色深（图3和图4）。表3.各组大鼠背根神经节和脊髓背角TRPV3的表达(±s )组别n背根神经节脊髓背角正常组80.23±0.010.33±0.01模型组100.25±0.020.37±0.02灸组100.26±0.041)0.41±0.021)2)灸组80.30&

20、#177;0.031)2)3)0.49±0.061)2)3)灸组80.27±0.021)0.48±0.031)2)3)注：与正常组比较,1) P0.05;,与模型组比较, 2) P0.05;与灸组比较, 3) P0.054 讨论灸法治疗RA历史悠久，且疗效确切。在此次实验中可通过对实验大鼠足跖肿胀度的观察结合大鼠滑膜细胞阳性凋亡数，直观判断 RA大鼠的病情。结果显示在RA造模后，大鼠足趾趾围显著增大，滑膜增生，细胞凋亡数不足；艾灸治疗后，灸组大鼠趾围下降趋势明显，肿胀显著减轻；滑膜较光滑，细胞凋亡数增加，提示20 min的艾灸疗效较好。 TRPV3作为温度感受器中

21、的一员，可受非外源性刺激物激活，可能在RA发病机制中起重要作用。此次实验中观察到造模后位于背根神经节与脊髓背根的TRPV3离子通道蛋白表达量均增多，可见RA可使TRPV3表达增加。有文献报道，炎症过程中产生的花生四烯酸或其他脂肪酸也可提高TRPV3的功能6。艾灸可通过TRPV3将艾灸刺激传入类纤维，到达背根神经节，然后转入脊髓背角7，中枢系统对刺激做出反应，机体由此产生相应变化。有研究发现，不同灸量导致大鼠穴位局部温度不同8，而不同的热刺激可影响到TRPV3的敏化程度7，因此可以推测不同艾灸时间对大鼠体内TRPV3的影响不同。此次实验中对RA大鼠进行不同时间的艾灸治疗，灸治5 min、20 m

22、in、 30 min均可使脊髓背角的TRPV3表达量增多，但艾灸治疗20 min对TRPV3的表达更具有促进趋势。TRPV3广泛分布在细胞膜及细胞器上，调节钙平衡。目前的研究结果表明, 细胞内Ca2+浓度的稳定对保持细胞活性似乎起着更为重要的作用, 不管是升高还是降低，均可能导致细胞凋亡9。结合有关文献报道6,10-11，可激活 TRPV3的温度：2339 ，也可导致 Ca2+内流, 引发细胞凋亡。结合此次实验结果，模型组背根神经节和脊髓背角的TRPV3表达量均高于正常组，但差异不显著，推测RA可能促使TRPV3表达增加，但不足以引发Ca2+ 内流,对滑膜细胞凋亡促进不明显，故可导致滑膜增生产

23、生病理现象。艾灸的温热效应促进TRPV3表达，可能会促使大量Ca2+内流，促进异常增多的滑膜细胞凋亡，从而减轻病理症状，发挥治疗效果。上述研究提示我们，艾灸时间过短，治疗RA大鼠关节肿胀及促进滑膜细胞凋亡的疗效不明显，适量时间的艾灸治疗，是产生疗效的必要因素。有关作用机制尚待进一步研究。参考文献1 Jiang JF, Wang LL, Xu B, Hu L, Song XG, Wu HG. Anti-inflammatory: effect mechanism of warming- dredging in moxibustion. Zhongguo Zhen Jiu, 2013, 33(9)

24、: 860-864. 2 Ueda T, Yamada T, Ugawa S, Ishida Y, Shimada S. TRPV3, a thermosensitive channel is expressed in mouse distal colon epithelium. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 383(1): 130-1343 Lu YX, Yue XP, Cai SC, Zhang JF. TRPV3 gene expression in human bladder carcinoma cells and its influence on

25、 bladder carcinoma cell proliferation and migration. Zunyi Yixueyuan Xuebao, 2014, 37(5): 508-516.4 Luo L, Hu L, He L, Tang ZL, Song XG, Dirckinck-Holmfeld L, Cai RL. Effect of moxibustion on ultrastructure of synovial cells in rheumatoid arthritis rats. Zhen Ci Yan Jiu, 2011, 36(2): 105-109.5 Zhang

26、 CY, Cai RL, Tang ZL. Influences of moxibustion on inflammatory factors and synoviocytes in rats with rheumatoid arthritis. Beijing Zhongyiyao Daxue Xuebao, 2014, 37(3): 190-194.6 Yang YH, Xu XD. Research status and progress on trpv3 channel protein. Zhong Nan Yaoxue, 2011, 9(11): 854-857.7 Yang YL, Wang C. M