CAT 测定方法

1、二、氧化氢酶的活性测定-高锰酸钾滴定法 原理 过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过 程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 据此，可根据H202的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经过酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 仪器和用具 研钵；三角瓶50ml4个；10ml酸式滴定管；恒温水浴锅；容量瓶25ml1个。 试剂 10H2SO4； 02mol?L-1磷酸缓冲液pH7.8;

2、 01mol?L-1高锰酸钾标准液；称取KmnO4(AR)3.160克，用新煮沸泠却的蒸馏水配制成1000ml,用0.1moL.L-1草酸溶液标定； 0.1mol.l-1H2O2：市售30H202大约等于176m01?L-1，取30H202溶液568ml,稀释至于1000ml,用标准0.1molKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定 0.1mol.L-1 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g,用蒸馏水溶解后，定容至1L。 方法 1酶液提取：取小麦叶片25g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲

3、液定容，4000r?min-1离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2取50ml三角瓶4个(2个测定，2个对照)，测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol01?L-1H202，同时计时，于30恒温水浴中保温10min，立即加入10H2S042.5ml 3用0.1mol?L-1KMnO4标准溶液滴定H202，至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。 4结果计算：酶活性用每克鲜重样品1min内分解H202的毫克数表示： 酶活（mg.g-1.min-1）= 式中 A-对照KMn04滴定毫升数(ml) B-酶反应后KMnO4滴定毫升数（ml

4、） VT-酶液总量（ml）; V1-反应所用酶液量（ml）W-样品鲜重（g） 1.7-1ml0.1mol.L-1的KMnO4相当于1.7mgH2O2. 注意 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。 三、过氧化氢酶的活性-紫外吸收法 原理 H202在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。仪器与用具 紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管0.5ml2支；2ml1支；10ml试管3支；恒温水浴锅。试剂 0.2mol?L-1pH78磷酸缓冲液(内含1聚乙烯吡

5、咯烷酮)；01mol?L-1H202(用01mol?L-1高锰酸钾标定)。 方法 1酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织05g，置研钵中，加入2-3ml 4下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将量瓶置5冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5下保存备用。 2测定 取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42-2顺序加入试剂。 25预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒

6、入石英比色杯，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按式42-3计算酶活性。 3结果计算 以1min内A240减少01的酶量为1个酶活单位(u)。过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）= 式中 Aso-加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2-样品管吸光值；Vt-粗酶提取液总体积(ml);V1-测定用粗酶液体积(ml); FW-样品鲜重(g); 01-A20每下降01为1个酶活单位(u);t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。 注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。 【思考题】1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2、过氧化

7、氢酶与哪些生化过程有关? 参考文献 【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170 【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12 【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22 【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版

8、社，1995 【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982 过氧化氢酶pH值范围4-9,而以7.0,37最适。冷冻、冻干、阳光、氧气降酶活。用Beers&Sizers法（改 进型）测定。见德B 施特尔马赫著，钱嘉渊译 酶的测定方法 p186-188。1.试剂：(1)1N氢氧化钠溶液：称2g，用蒸馏水定容至50ml。(2)磷酸盐缓冲液（pH7.0）：取0.68g磷酸二氢钾，溶于75ml蒸馏水，用1N氢氧化钠溶液将pH调至7.0，定容至100ml。(3)底物溶液：现配。用磷酸盐缓冲液把0.6ml过氧化氢（30的H2O2）稀释至100ml。(

9、4)酶液浓度应为5-20u/ml。2.操作： 用移液管将1.0ml底物溶液和1.9ml蒸馏水滴入一只1厘米比色皿，并调水温至25。为检查在不加酶的情况下吸光度是否也降低，在240nm处以蒸馏水为参比测定吸光度，若吸光度的降低幅度超过0.01，则在计算主值时须减去此值。取另一比色皿，加入上述溶液，并加0.10酶溶液，在240nm处以蒸馏水为参比在连续5分钟内测定吸光度（每隔1分钟读取一次结果，直至每分钟吸光度的降低值达到稳定为止）。3.计算：在上述条件下，每分钟酶促分解1umol过氧化氢的酶量定为1个酶活力单位。U/mg = E240×3 / 0.0436×Ew式中：E240

10、240nm处每分钟内吸光度的降低值 Ew每0.10ml所用酶液中含酶的重量（mg） 0.0436240nm处1umol过氧化氢的吸光度 3反应混合液的总体积。5 波钦诺克 X H 著.植物生物化学分析方法.荆家海，丁钏荣译.北京:科学出版社，1981.205207参考文献【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂

11、过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982实验13 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子

12、的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸

13、溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。四、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另

14、两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。五、结果酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）（AB）×VT/(W×VS×1.7×t)式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g

15、）；t反应时间（min）；1.71ml0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH2O2。过氧化氢酶活性测定一、目的：植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。二、测定方法：（一）过氧化氢分解量测定法原理：过氧化氢酶（catalase）能把过氧化氢分解为水和氮，其活性大小，以一定时间内分解的过氧化氢的量来表示。当酶与底物（过氧化氢）反映

16、结束后，再用碘量法测定未分解的过氧化氢量。以钼酸铵做催化剂，使过氧化氢与碘化钾反映，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应为：H2O2+2KI+H2SO4I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6(二) 氧量测定法原理：过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，根据一定时间内放出的氧量来表示。（三）过氧化氢酶的活性测定高锰酸钾滴定法原理： 过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过 程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 据此，可根据H202的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反

17、应过量)的H2O2溶液，经过酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2 。5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4（四）过氧化氢酶活性测定紫外吸收法原理：过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。三、过氧化氢分解量测定法的仪器与试剂（一）植物材料小麦或其他植物新鲜叶片（二）仪器与用具天平，研钵，100ml容量瓶2个，50ml的酸式滴定管1支，恒温水浴锅，10ml移液管的1支，5ml移液管的2支，1ml移液管的1支

18、，100ml的三角瓶4个。（三）试剂与配制1碳酸钙粉末23.6N硫酸：取1000毫升烧杯一只，加入约500毫升蒸馏水，边搅拌边加入100毫升浓硫酸，冷却后用1000毫升的容量瓶定容。31%淀粉溶液：取1克可容性淀粉于小烧杯中加约20毫升水调匀，慢慢倾入约80毫升沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾，冷却后贮存于滴瓶中（可加少量的碘化汞防腐）。410%钼酸铵溶液：称取钼酸铵10克，容于蒸馏水中使成100毫升。50.1N硫代硫酸钠：称取Na2S2O3?5H2O 25克，容于新煮沸并冷却过的蒸馏水中，加入约0.1克Na2CO3,并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。一天后进行标定。60.02N硫代硫

19、酸钠：用20毫升移液管吸取标定过的0.1N硫代硫酸钠溶液20毫升，加入100毫升的容量瓶中，加水定容，摇匀即成，用时现配。70.1N过氧化氢：取1毫升30%的过氧化氢用水稀释至150毫升，用0.1N硫代硫酸钠标定。（四）方法步骤：1酶液提取：称取混匀的新鲜植株叶片0.25克（尽量不要切叶脉），置研钵中加0.2克碳酸钙和PH7.8的磷酸缓冲溶液5毫升，仔细研磨成匀浆，通过漏斗移入15ml试管中，再用5ml该缓冲溶液冲洗钵体，一并转入漏斗过滤，所得滤液即为待测酶液。2.测定：取100毫升三角评4个，编号。向各瓶准确加入稀释后的酶液10毫升，立即向3，4号瓶中加入3.6N硫酸5毫升以终止酶活性，作为

20、空白测定。然后将各瓶放在25°C水浴中保温5min，向各瓶准确加入5毫升0.1N过氧化氢，摇匀并记录加入时间，将各瓶仍放在20°C水浴中让酶作用5分钟后；再依次向1、2号瓶加入5毫升3.6N硫酸，然后向四个瓶中各加入1毫升20%KI，3滴钼酸铵,用0.1mol/l硫代硫酸钠滴定至淡黄色消失后，加入2滴淀粉指示剂，再用0.1mol/l硫代硫酸钠滴定至蓝色消失，记录硫代硫酸钠消耗量。3过氧化氢酶活性的计算：从空白滴定值减去样品滴定值，即可求出此期间被酶所分解的过氧化氢量。被分解H2O2量（mg）=空白滴定值（ml）-样品滴定值（ml）*代硫酸钠浓度（N）*17过氧化氢酶活性被分

21、解H2O2量（mg）/测定时用酶液（ml）*酶液总体积（ml）/样品重（g）/时间（min）（五）注意事项1、 三角瓶、容量瓶等务必要清洗干净。2、 研磨时CaCO3不要加得太多，大半匙即可，且要洒均匀。3、 过滤时不必全部过滤完，有20ml滤液即可。4、 把握好实验进度，不拖延时间，以免酶液失活。5、 滴定时速度不要过快，以免过量（最快不要超过1秒/滴）。最佳终点为最后半滴加入后蓝色消失。6、 每次滴定起点一致，都从零开始。7、 左手操纵活塞，右手摇三角瓶，溶液要摇成漩涡状。8、为了保证实验的平行性，四个三角瓶里所加的试剂应该来自同组药品，中途不要试剂瓶（使用别组药品）。（六）常识1、加入过

22、氧化氢之前为什么要保温平衡？答：为了使三角瓶中的溶液温度达到过氧化氢酶的最适酶促反应温度。过氧化氢酶的酶促反应最适温度为2025，受实验室条件限制，如果室温在这个范围内则不进行水浴，在空气中保温。2、为什么有个别组在加入KI溶液后有黑色沉淀出现？答：因为KI溶液放置时间过长易被空气中的氧气所氧化，出现单质I2，这样再加上被过氧化氢所氧化而得的I2，就可能在三角瓶中出现单质I2过饱和，从而析出变成沉淀。遇到这种情况应该更换KI溶液重做。3、为什么不能用NaOH代替H2SO4终止酶活性？答：H2SO4除了利用强酸性终止酶活外还参与氧化还原反应，参与KI生成I2的氧化还原反应; NaOH虽然有强碱性

23、可以终止酶活，但不能参这个反应，这样无法测出过氧化氢的量4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O21ml H2O2定容至100ml方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）0.2ml 0.3% H2O2迅速颠倒混匀，开始计时1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)122 CAT提取方法方法 ：按文献3i己述的方法。取花瓣100 g，加入少量石英砂、质量分数10的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，及i00 mg的

24、CaCO3、2O0 mL水，冰浴研磨；用50 molL pH 70的磷酸缓冲液定容至10 mL；过滤；取滤液1O0 mL，稀释lO、i00、200、500、1 000、2 000倍。此为CAT粗酶提取液。方法 ：按文献4记述的方法。取花瓣0500 g， 加入10lL质量分数10的PVP， 及少量石英砂、2 mmolL的EDTA、25 mmolL的DTT、体积分数05的 一巯基乙醇，冰浴研磨；6 000 rmin、4cC离心20 min；取上清液，稀释10、100、200、500、1 000、2 000倍。此为CAT粗酶提取液。123 CAT 活性测定方法方法 ：文献1记述的碘量滴定法。碘量法利

25、用H20z能将KI中的I一氧化，生成Iz， 以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成Iz的量，再换算成所消耗Hz0z的量。方法 ：文献3记述的紫外分光光度碘量法。该方法利用I 在波长350 nm处有一个吸收高峰， 吸光度与I 的含量成正比来计算生成Iz的量。用UV一120光度计测定样品对波长为350 nm光线的吸光度(OD值，用“0D350” 表示)。方法 ：直接紫外分光光度法。该方法利用H2oz在波长294 nm处有一个吸收高峰4，吸光度与lH20 含量成正比来计算。取CAT粗酶提取液100 mL， 加入30molL的H202 200lL，迅速混匀，用UV一120光度计测定反应

26、开始后4 min内对波长294 nm光线的吸光度(用“OD 表示)的数值变化AOD2g4。以100 mL CAT粗酶提取液与200mL H20的混合液为空白对照。CAT与H202反应只在前5 min内呈线性关系， 因此要在酶加底物后的30 S内读出原始读数。124 数据分析方法试验数据采用国际通用统计分析软件SAS 612进行分析。利用外标法测定CAT活性。即配制浓度为0、1、5、10、15、20 pnol·L 的H202标准溶液；取2o0lL各种浓度的H20 溶液，各加入100lL用方法提取的CAT酶的100倍稀释液，反应4 min后测定CAT活性；用300IL水调0。结果如表3。

27、-测定切花中过氧化氢酶活性的3种常用方法的比较、陈晓敏 (华南热带农业大学园艺学院 海南儋州 571737)方法二 过氧化氢酶的活力测定紫外吸收法H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。三、材料、仪器与试剂（一）、材料：小麦叶片（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴； （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告

28、中提出方案后教师审定后并配制）0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。四、实验操作：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入23ml 4下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5下保存备用。2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。表4

29、0-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S0S1S2粗酶液(ml)0.2（煮死酶液）0.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水(ml)1.01.01.025预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活力。五、计算以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活力(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2样品管吸光值； Vt粗酶提取液总体

30、积（ml）； V1测定用粗酶液体积（ml）； FW样品鲜重（g）； 0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。六、注意事项凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。七、思考题1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?三、过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】 紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2m

31、l刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 【方法】 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入23ml 4下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5下保存备用。2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-

32、2顺序加入试剂。表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水(ml)1.01.01.0 25预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2样品管吸光值；

33、 Vt粗酶提取液总体积（ml）； V1测定用粗酶液体积（ml）； FW样品鲜重（g）； 0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。过氧化物酶(POD)活性的测定【实验原理】植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。(CAT)催化如下反应：2 H2022 H20+ 02本实验通过测定H

34、202的减少量来测定CAT的活性。在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【试剂药品1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸缓冲液至 50ml3.0.2% 愈创木酚 :秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至 100ml【实验步骤】酶液的制备1.称取叶片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2. CAT活性的测定在3ml的

35、反应体系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。3. POD活性的测定在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, .0.2% 愈创木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录470nm处OD增加速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。4. 用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。参照Jiang和Zhang（2001，2002）的方法，取约0.2克材料置液氮中研磨成粉。6mL提取液（50 mmol L-1 Na2HPO4-