AM-AM-FS-Eu-0014代谢物一种常规方法,使用GC-MS电子碰撞习惯测定牛尿中代谢物的残留量(2)

1、AMAMFSEu0014牛尿 代谢物 残留量 GC MS电子碰撞法AM-AM-FS-Eu-0014代谢物一种常规方法，使用 GCMS电子碰撞方式测定牛尿中代谢物的残留量。1. 使用范围：此方法是尿样日常筛选法，也同样适用于睾酮，群勃龙，雌二醇，雌酮，折仑诺，顺式和反式己烯雌酚，己雌酚，二烯雌酚，19- 去甲睾酮，甲基睾酮，乙炔基雌二醇， boldenone, stanolone, norethandrone, 大力补， bolasterone, 氯代睾酮，氯代羟基甲基雄甾稀酮，乙稀基雌二醇，乙炔基雌二醇，氧化黄体酮，氯地孕酮和甲地孕酮。2. 原理概要：此方法由六部分组成：用醋酸缓冲液分解尿样；

2、在 C18 柱上提取；用碳酸缓冲液冲洗；在硅胶柱上分离代谢物组分；衍生物；用 GCMS电子撞击方法测定。3. 主要试剂和仪器3.1. 主要试剂：标准化合物：类固醇类：睾酮，群勃龙，雌二醇，雌酮，折仑诺，顺式和反式己烯雌酚，己雌酚，二烯雌酚，19- 去甲睾酮，甲基睾酮，乙炔基雌二醇， boldenone,stanolone, norethandrone,大力补， bolasterone, 氯代睾酮，氯代羟基甲基雄甾稀酮，乙稀基雌二醇，乙炔基雌二醇，氧化黄体酮，氯地孕酮和甲地孕酮；内标化合物：氘化（ 3）甲基睾酮（sigma）；氘化（ 2） 17雌二醇 (sigma)；外标化合物：二氯苯 (Ald

3、rich)；去甲孕酮 (Sigma) ；化学试剂：甲醇；超纯水（ >18M. m）；正己烷；葡糖苷酸酶芳香基硫酸酯酶碳酸钠；氢氧化钠；醋酸钠；冰醋酸；乙酸乙酯；无水乙醇硅胶 60；三氯乙烷N甲基 N三甲基硅烷基三氯乙酰胺（MSTFA）三甲基硅烷基咪唑（ TMIS）二硫代苏糖醇（ DTT）N甲基 N（三丁基甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MTBSTFA）氦气；氮气溶液 :2M醋酸缓冲液， PH5.2±0.2 。用 900ml 水溶解 164g 醋酸钠，用冰醋酸调节为 PH5.2± 0.2 ，用水定容至 1L，4贮存，使用 1 个月。10%碳酸钠溶液：溶解 100g 碳酸钠至 1

4、L 水中。洗脱液：洗脱液 1：甲醇 / 乙酸乙酯（ 30/70 ）洗脱液 2：三氯乙烷 / 乙酸乙酯（ 80/20 ）洗脱液 3：三氯乙烷 / 乙酸乙酯（ 20/80 ）衍生化试剂：在无水条件下制备， MSTFA/TMIS/DTT100/5/5（V/V/W），保存在冰箱中，避光，防潮。3.2. 仪器：C18 柱子（ Varian AI 122560 15）：在 10ml 容器中取 2g 树脂，分别用 10ml 甲醇和 10ml 超纯水洗树脂， 不能干柱；G60硅胶柱；取一根 15cm× 10mm i.d. 玻璃柱：制备：把硅胶放入含有洗脱液 2 中（ 1，1，1三氯乙烷 / 乙酸乙酯

5、 80/20 ）搅拌，装入玻璃柱，树脂高度至少 8cm，用洗柱子，最后再用 10cm 洗柱子，不要干柱，柱子用前准备；GC MS；GC：无分流；进样体积： 2ul ；柱子：石英硅毛细管柱，30cm×0.25mm i.d.液膜厚度温度：进样口 280，连接线 280；15 min5 min20um，SE30。柱温： 120，1 分钟 250 300，4 分钟，然后降至 120载气： He；流速： 1mlmin柱头压力： 5PS；MS:EI方式70ev。收集时间（ msec）2。电子倍增器。4. 过程简述4.1.使尿样融化。4.2.离心 3000 转，转移 20ml 上清液到塑料容器中。

6、4.3.加入 2mL醋酸缓冲液，用冰醋酸调节 PH5.2±0.2 ，加入 200ng d 3甲基睾酮。4.4.取两个空白尿样重复 4.1 4.3 步骤，一个空白加入类固醇标准。4.5.加入 100ul 葡糖苷酸酶芳香基硫酸酯酶在尿样中， 52在烘箱中孵育15 小时。净化。转移水解的尿样至C18 柱中，用氮气吹干柱子 30 秒钟，用超纯水 10mL洗柱子，抽真空使水排尽， 再用 10ml 正己烷洗柱子。 用 5ml 洗脱液 1 洗脱所有类 固醇至 12ml 试管中。4.7.加入 2ml 碳酸缓冲溶液至试管中旋转混匀 10 秒钟， 10，000 转离心 1min，转移上层有机相到干净试管

7、中。4.8.重复以上步骤，加入 2ml 碳酸缓冲溶液至有机相中旋转混匀 10 秒钟， 10，000 转离心 1min，合并上层有机相。4.9.在 50氮气条件下 , 旋转蒸发有机相至近干 , 避免残留物热分解。4.10. 用硅胶 0 柱净化。加入 10ml 洗脱液 2 到残留物中，旋转放入超声波中几秒钟转移此溶液至硅胶柱中，排尽。用0.5ml 洗脱液 2 重复（）步骤。再用 4ml 洗脱液 2 洗柱子。4.10.4. 用 13ml 洗脱液 2洗脱雌激素，收集第一部分， 加入 100ng 三氯苯作为外标。4.10.5. 用 12ml 洗脱液 3洗脱雄性激素， 收集为第二部分， 加入 100ng 二氯苯作为外标。4.11.在 50氮气条件下，浓缩、部分至大约 500l 。4.12.旋转试管使壁湿润，然后 1000 转离心 1 分钟，把全部液体甩入试管底部。4.13.转移全部液体到反应管中，在 50氮气条件下，旋转蒸发干。4.14. 衍生化（必须无水条件下）加入 20l 衍生化试剂立即盖上盖，旋转超生，加热 60， 30min。衍生化立即进样，也可以密封试管在 4贮存 48 小时。4.15. 进 2ul 样到 GC-MS仪器。5. 结果说明类固醇保留时间在表 I 显示，它们是变化的， 应该系统地研究与内标相对保留时间。