EGFRvⅢ胞外段修饰树突状细胞诱导CTL细胞对胃癌细胞的作用

1、EGFRv 胞外段修饰树突状细胞诱导 CTL细胞对胃癌细胞的作用目的研究表皮生长因子受体型突变体 (EGFR v) 胞外段修饰树突状细胞诱导 CTL细胞对 EGFR v阳性的胃癌 7901细胞的杀伤作用 , 初步探讨其作用机制。方法构建表达 EGFR v的慢病毒 , 应用荧光定量法测定其滴度 , 采用密度梯度离心法从人外周血中分离 T 淋巴细胞和单核细胞 , 利用细胞因子 rhIL-4(100ng/ml),rh GM-CSF(100ng/ml) 及 rh TNF-a(50ng/ml) 诱导单核细胞向树突状细胞 (DC)分化, 通过流式细胞仪检测树突状细胞表面抗原CD80,CD83,HLA-DR

2、验证 DC的成熟, 用含有 EGFR v的慢病毒转染 DC,应用Western-blot 测定 EGFRv 在 DC的表达, 用 ELISA法, 检测上清中的 IL-10 和IFN- 分泌量。空白 DC,EGFRv 慢病毒感染的树突状细胞、阴性对照的树突状细胞与 T 淋巴细胞按照 1:5,1:10,1:20,1:40 共培养,72h 后加入 CCK-8,放入 37的二氧化碳的培养箱培养 4 小时, 之后显微镜下观察 , 然后用酶标仪检测加入 CCK-8后, 在波长为 450nm的情况下每组混合细胞培养后的上清液的的吸收值 , 将从成人外周血中培养的 T 淋巴细胞分别与空白 DC,EGFRv 慢

3、病毒感染的树突状细胞、阴性对照的树突状细胞在 37共培养( 刺激细胞/ 效应细胞=1:20) 收集细胞培养的上清, 取传代后的 SGC7901细胞和 SGC7901-v做为靶细胞 , 按不同比例的效应细胞和靶细胞的比例 (1:5,1:10,1:20,1:40) 加入不同组的 T 细胞, 继续培养 24 小时,MTT法测定杀伤情况。以上所有实验均重复 3 次。结果 1、利用密度梯度离心法和细胞因子诱导法成功培养出了成熟的树突状细胞和 T 淋巴细胞。 2、未加入 TNF-a 的树突状细胞 CD80,CD83,HLA-DR表达率为:35.5%,25.1%,33.2%, 加入 TNF-a 的CD80,

4、HLA-DR表达率为:82.7%,69.6%,感染 EGFR v的树突状细胞 CD-80,HLA-DR-APC表达率为 :86.3%,76.0% 。3、慢病毒携带目的基因 EGFRv 感染树突状细胞 ,Western Blot 检测 EGFRv蛋白结果显示感染过的 DC对EGFRv的表达率为 58%。4、显微镜下观察携带目的基因 EGFR v的慢病毒感染树突状细胞可获得较高的感染率 , 达 60%。5、感染 EGFRv的 DC与自身 T 淋巴细胞混合培养 , 可刺激 T 淋巴细胞产生更多的具有抗肿瘤活性的细胞因子 IL-10 及 INF-r, 且呈剂量依赖性。 6、同等条件下 EGFRv 胞外段修饰树突状细胞诱导 CTL细胞对 EGFRv 阳性胃癌 7901细胞的杀伤作用更强。结论 1、从人外周血通过密度梯度离心及细胞因子刺激法可获取高纯度的 T淋巴细胞及树突状细胞 ,TNF-a 是促进树突状细胞成熟的关键。 2、树突状细胞刺激 T 淋巴细胞产生具有杀伤活性的细胞因子 IL-10 及 INF-r, 可杀伤胃癌