PD-1在冠心病患者外周血T细胞表达的意义及辛伐他汀的调节作用

1、PD-1 在冠心病患者外周血T 细胞表达的意义及辛伐他汀的调节作用冠心病 (Coronary Heart Disease,CHD)是人类健康的主要杀手。心脏病流行病学调查资料表明 , 随着生活方式的改变 , 我国的 CHD患病率和死亡率呈逐年上升趋势 , 据世界卫生组织 (WHO)估计：到 2020 年左右 , 我国会迎来冠心病的 “流行”顶峰。动脉粥样硬化 (Atherosclerosis,AS)是冠心病发病的病理基础, 人们从500 年前埃及木乃伊的动脉中就已发现粥样硬化性病变。人类认识 AS是一种疾病并对其发病机制进行相关研究已有100余年的历史。有关 AS的发病机制学说数量众多, 其中

2、包括内皮损伤学说、 脂质浸润学说、 血栓源性学说、动脉平滑肌细胞增殖学说等。而自1999 年 Ross 提出 AS的炎症反应机制以来 ,AS 的炎症反应机制也已经广泛被医学界认可。研究证实 , 炎症参与了 AS形成及发展的各个阶段 , 直至最终的血栓并发症。而近年来 , 免疫因素在 AS的发生发展中的作用正在被人们认识并引起重视, 更有学者提出 AS是一种自身免疫性疾病。在AS中 , 多种参与免疫细胞和炎症因子构成了错综复杂的相互协同、相互影响的网络, 炎症和免疫共同影响着AS的进程。T 淋巴细胞是重要的免疫细胞, 参与特异性免疫反应 , 它与 AS的关系国际上已有不少研究。 AS的病理改变特

3、点为平滑肌细胞增殖、脂质沉积、巨噬细胞和淋巴细胞浸润、泡沫细胞形成。在人类AS的各个时期都有不同程度的淋巴细胞浸润 , 其中以 T 细胞为主。活动性斑块与稳定性斑块比较,T 细胞显著增加。许多关于人类和啮齿目动物的研究证实 ,T 淋巴细胞促进粥样硬化斑块的炎症反应, 影响损害的进展及重塑。主要表现在以下几点：1.T 细胞与斑块中其他免疫细胞及分子相互作用, 促进粥样硬化；2.T 细胞参与 ox-LDL 抗体、Hsp抗体等与 AS相关的自身抗体形成；3. 杀伤性 T 细胞溶解破坏巨噬细胞 , 释放大量促粥样硬化物质； 4.T 细胞在不稳定性斑块形成及斑块破裂中可能起一定作用。T 细胞活化是其发挥

4、病理生理作用的前提。 而 T 淋巴细胞的活化需要两个信号 , 第一个信号是 T 淋巴细胞表面的 TCR-CD3复合物同抗原递呈细胞 (APC)上的MHC-类抗原肽复合物结合, 赋予免疫应答的特异性, 但不引起T 细胞增生和分泌细胞因子；第二个信号是抗原非特异性的共刺激信号, 由T 细胞上的共刺激分子与 APC表面的配体结合所诱导 , 启动维持并调节活化级联反应, 决定了 T细胞是活化增殖 , 或者转变为无反应状态甚至凋亡。重要的共刺激分子及其配基有：B7/CD28,血管细胞黏附分子 (VCAM)-1/ 迟现抗原 (VLA)-4, 细胞间黏附分子(ICAM)-1/ 淋巴细胞功能相关抗原 (LFA

5、)-1, LFA-3/CD2, CD40/CD40配基 ,CD70/CD27等。近年来 , 一些新的共刺激分子陆续被发现, 它们似乎在调节已活化的T 细胞反应中有独特的重要性。负性共刺激分子PD-1 (Programmed death-1) 和其配体PD-L (Programmed death-1 ligand)相互作用提供淋巴细胞活化的抑制信号, 和正性共刺激信号形成了一个复杂的信号网络, 综合调节免疫反应 , 在免疫活化和耐受中起关键作用。 PD-1 分子是免疫球蛋白超家族激活诱导的抑制性受体, 是拥有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM) 和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM) 的型跨膜蛋白

6、, 可诱导性表达于活化的CD4+T细胞和 CD8+T细胞、 B 细胞、 NK细胞及骨髓细胞。PD-L1(B7-H1) 和 PD-L2(B7-DC)是 PD-1的两个配体 ,PD-L1 主要表达在树突状细胞、单核 / 巨噬细胞、 B 细胞、激活的 T 细胞 , 在内皮细胞、肿瘤细胞上也有表达 ,IFN- 、 可上调其表达。 PD-L2 在树突状细胞、单核细胞上表达 ,IL-4 、GM-CSF在体外强力诱导树突细胞上PD-L2的表达。 PD-1-PD-L 结合后 , 发挥对效应 T 细胞的负性调控作用 , 可抑制 T 细胞增殖和产生细胞因子 IL-10 、IFN- 等。在免疫反应的起始部位和效应部

7、位双重抑制免疫反应 , 防止过度的免疫损伤和自身免疫性疾病的发生, 有利于维持机体的免疫自稳。PD-1 负性共刺激信号的缺失会导致多种自身免疫性病变。动物实验显示 ,PD-1 信号缺失导致小鼠发生类风湿关节炎及狼疮样自身免疫性肾炎, 导致 NOD小鼠自身免疫性糖尿病的快速进展。增加 PD-1负性共刺激信号可使AS兔粥样斑块中 T 细胞浸润减少及炎性反应减轻 , 减轻实验性脑脊髓膜炎 (EAE)程度 , 使脊髓浸润的巨噬细胞、CD4+、 CD8+T细胞消失。近年来研究者们对PD-1 在临床疾病的表达的研究发现, 病毒感染 ( 如HBV、HIV) 、寄生虫感染、移植免疫、自身免疫病( 如系统性红斑

8、狼疮、系统性硬化 ) 、肿瘤等多种疾病 , 都存在 PD-1 及其配体 PD-L 的表达异常 , 显示出 PD-1 信号在对维持外周耐受及免疫自稳方面起到保护性作用。 他汀作为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂 , 是有效的降脂药物。除调脂作用之外 , 他汀还具有包括改善内皮功能、增加 NO生物利用率、抗氧化、稳定斑块、调节祖细胞、抗炎、免疫调节等多重血管保护作用。其抗炎及免疫调节方面的功效已在多种疾病如类风湿关节炎、多发性硬化的应用中体现。 AS是一个慢性炎症反应 , 且具有自身免疫的特点 , 而 PD-1 在其中的作用机理尚不清楚。本研究通过对免疫负性调控信号分子PD-1 在

9、 CHD患者外周血 T 淋巴细胞(PBTC)的表达情况的检测 , 初步分析了其在AS发病及进展中的意义； 利用特异性PD-1 阻断抗体研究其对AS患者 PBTC的免疫学调节作用 , 进一步推测 PD-1 在 AS中的调控机制；并通过观察辛伐他汀(Sim) 对 PD-1 在 CHD患者 PBTC上的表达的调节作用 , 为 PD-1 作为 AS免疫学治疗提供新的理论依据。第一部分：CHD患者PBTC上 PD-1 的表达目的：研究PD-1 在 CHD患者 PBTC上的表达 , 初步探讨其在AS发生发展中的意义。 方法：选择 CHD患者 (55 例 ) 为研究对象 , 其中稳定性心绞痛 (SA) 患者

10、 27 例, 急性冠脉综合征 (ACS)患者 28 例,30 例经冠脉造影证实的非CHD患者为正常对照组 , 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),分别用免疫荧光、流式细胞术及RT-PCR检测 PD-1 蛋白及 mRNA在 T 淋巴细胞上的表达情况。结果：1. 直接免疫荧光观察PD-1 蛋白表达于 PBTC的表面。2. 流式细胞术检测 PD-1蛋白表达 PD-1在 PBTC上的表达在 SA患者组表达率为 (9.29 ±2.34)%,ACS患者组为 (8.19 ±2.36)%, 正常对照组为 (18.52 ±3.28)%。两组 CHD患者的 PD-1表达率

11、低于正常对照组 , 差异具有显著性P<0.001)。3.RT-PCR检测 PD-1mRNA在 PBTC的表达 PD-1mRNA结果显示 SA组患者表达量为 0.552 ±0.079,ACS 组为 0.477 ± 0.081, 均低于正常对照组的0.928 ±0.057(P<0.001)。结论： PD-1 在 CHD患者 PBTC上的表达明显降低 , 这可能在AS的发生及发展中起到作用。第二部分PD-1 对体外培养 CHD患者 PBTC的免疫学调控作用目的：研究PD-1 对体外培养 CHD患者 PBTC的免疫学调控作用。方法：PBTC分离

12、与纯化同前。 7 例 CHD患者和正常对照来自前一实验样本人群。正常人及 CHD患者的 PBTC新鲜分离纯化后 , 各分为 4 组, 与另一健康人来源的成熟树突状细胞 (mDC)以 20：1 比例混合 , 置于 37的 CO2培养箱共培养 ,72小时后收集各组上清液ELISA 法检测 IFN- 、IL-4 。3H-胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR) 掺入率反映 T 淋巴细胞的 DNA合成。实验分组：1)PBTC组：PBTC加等体积的 PBS作为阴性对照组； 2)PBTC+mDC组： PBTC与 mDC共培养； 3)PBTC+mDC+PD-1Ig组： PBTC与 mDC共培养体系中加入鼠抗人PD-1

13、 抗体 ( 终浓度为 10g/ml) ；4)PBTC+mDC+Ig组： PBTC与 mDC共培养体系中加入鼠抗人同型对照 Ig( 终浓度为 10 g/ml) 。结果： 1.PD-1 共刺激分子对 CHD患者和正常人 PBTC增殖作用的影响：正常对照及 CHD患者不同处理组之间差异有显著性意义 (P<0.001)。PBTC+mDC+PD-1Ig组 3H-TdR掺入率较 PBTC+mDC组增加有显著性意义(P<0.001),而加入同型对照抗体则无变化(P>0.05)。析因方差分析显示 ,CHD患者组 PD-1 阻断后 ,PBTC增殖程度低于对照组 , 即

14、PD-1 分子抑制 T 细胞增殖的作用减弱。 2.PD-1 共刺激分子对 CHD患者和正常人 PBTC分泌细胞因子作用的影响：正常对照及 CHD患者 PBTC组、 PBTC+mDC组、 PBTC+mDC+PD-1Ig组和PBTC+mDC+Ig组的 IFN- 、IL-4 表达量组间差异具有显著性。LSD比较分析表明 ,PBTC+mDC组比 PBTC组 IFN- 和 IL-4 分泌增加有显著性意义 ( 均 P<0.001)；在 PBTC+mDC组加入 PD-1-Ig 后,IFN- 和 IL-4 分泌均增加 , 有显著性意义 ( 均 P<0.001),而加入同型对照抗体则

15、变化无显著性意义(P>0.05)。析因方差分析显示 ,CHD患者组 PD-1 阻断后 , 细胞因子产生增加程度低于对照组 , 即 PD-1 抑制 T 细胞因子产生的作用减弱。结论：CHD患者及正常人体内 PD-1共刺激分子在抑制PBTC增殖与分泌 IFN- 和 IL-4 发挥着重要的作用。CHD患者较正常人比较这种抑制作用相对减弱。第三部分辛伐他汀对PD-1在 CHD患者 PBTC表达的调节作用目的：观察辛伐他汀(Sim) 对 PD-1 在 CHD患者PBTC表达的调节作用 , 初步探讨他汀药物的免疫学调节AS的新机制。方法：取12 例 CHD患者新鲜外周血15ml, 密度梯度离心法得到PBMC,并分为 3 个组：取分离出的 CHD患者 PBMC,同一患者细胞再分为空白对照组与Sim 组：分别加入等体积的 PBS与 Sim( 终浓度分别为 10-6mol/L 和 10-5mol/L) 。24 小时小时后收集细胞 , 洗涤并调整浓度为