qPCR实验操作流程

1、Q-PCR实验流程一、 实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20 分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/ 一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。取EP 管 / 枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/ 枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用 75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、 总 RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后， 用 1ml 枪将 PBS吸干净，加入 1ml Trizo

2、l（ Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至 1.5mlRNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol（ Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min 使其充分裂解； （管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入 200l氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置 3-5min ；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3） 4 下， 14,000g 离心 15min，可见分为三层， RNA在上层水相，移至另一个新的RNase freeEP管；（用 20-200ul

3、的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀 RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8 次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5） 4下， 14,000g 离心 10min，收集 RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在 -80 度冰箱过夜，继续在4下，14,000g 离心 10min，收集 RNA沉淀），去上清；6） 用 75乙醇洗涤两次 （12,000g 离心 5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀） ，超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）

4、 视沉淀量加入适量DEPC水（至少 15ul ）溶解沉淀。三、去基因组使用 RNase-free 的 DNase ?（ Promega），按以下体系配置反应液， 37消化 30min， 65灭活 10min。RNA30lDNase ?20l10 x buffer10lH2O(RNase free)39.lRNasin5l0.5总体积100l然后按以下步骤操作：1)加入等体积的苯酚/ 氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm ，离心 15min，取上清。2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm ，离心 15min，取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分

5、混匀（颠倒6-8 次）， -20 静置 15min；4）4下， 14,000g 离心 15min，收集 RNA沉淀，去上清；5）用 75乙醇洗涤两次（12,000g 离心 5min），超净台风干；6）加入适量 DEPC水（至少 15ul ）溶解沉淀。四、总 RNA纯度和完整性检测1） 纯度检测：取1l RNA 样品 50 倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值， OD260/OD280 的比值大于 1.8 ，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2） 总 RNA完整性检测：取 RNA样品 1l ，1琼脂糖凝胶电泳80V× 20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA

6、的 5s rRNA，18srRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA：1)在 RNase free的 PCR管中配置下列溶液.Total RNAgH2O1.0l2) 将上述溶液吹总体积12l打均匀，置85保温5min ，使 RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止 RNA复性；3) 在该 PCR管中加入下列试剂（ Promega）oligo （dT）0.5lRandom primer0.5l10mM dNTP2.0lRNase inhibitor0.5l5 x buffer4.0lM-MLV0.5l总体积8.0l4) 将上述 20l反应溶

7、液 30保温 10min；5) 42保温 50min；6) 85保温 10min；7) -20 保存。2. microRNA ：使用茎环逆转录法，原理如下图：1） 在去 RNase的 PCR管中配置以下溶液.total RNA1.0gX 个 miR 逆转录引物0.5*XlH2O2）将上述总体积12.5l 溶液混匀，85 孵育 5min，以打开 RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；3） 在另一去 RNase的 PCR管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega)2.0lRNase inhibitor (promega)0.5lU6 逆转录引物0.5l5x

8、 buffer4.0lM-MLV (promega)0.5l总体积7.5l4） 将 3）溶液加入到 1）溶液中，混匀后30保温 10min；5） 42孵育 50min；6） 85孵育 10min 灭活逆转录酶。四、定量 PCR检测1. 引物测试：根据 mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct 值小、扩增效率高的引物进行正式实验。

9、2确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1）一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3正式实验：体系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物0.5ul（ 10uM）下游引物0.5ul（ 10uM）总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5 份 -1 份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8 连管中。3cDNA用

10、灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20 稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10 或 1:5 。cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12 的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。）4把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五上机：5.1先开电脑，进入Windows 界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2打开 7500 软件，选择“新建” ，在“ Template ”下拉菜单中选择 “60”或“ 65”（普通基因检测为“60”， MicroRNA 检测为“ 65”）5.3打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。5.4点击File菜单中Save，输入要保存结果的文件名，命名为日期- 上机时间- 客户名字简写，如100830-1008-WL表示8 月30 日10 点08 分魏立的实验。5.5点击 Start键，开始运行程序。5.6程序运行完