精氨酸加压素及其受体对大鼠心肌成纤维细胞iNOS

1、精氨酸加压素及其受体对大鼠心肌成纤维细胞iNOS【关键词】精氨InfluencesofargininevasopressinanditsreceptorsoniNOSNOsystemactivityincardiacfibroblastsAbstractAIM:Toexploretheinfluencesofargininevasopressin(AVP)anditsreceptorsoninduciblenitricoxidesynthasenitricoxide(iNOSNO)systemactivityincardiacfibroblasts(CFs).XETHODS:AfterCFsw

2、ereisolatedandcultured,nitricacidreductasemethod,spectrophotometryandRTPCRwereusedtodetectthechangesofiNOSNOsystemactivityinducedbyAVPanditsreceptors.RESULTS:AVPsignificantlyenhancedCFsiNOSNOsystemactivity.VIreceptorantagonistinhibitediNOSXOsystemactivityinaconcentrationdependentmannerand1X10-7mol/L

3、VIreceptorantagonistdecreasediNOSNOsystemactivitytothecontrollevel.VIreceptorantagonistandV1+V2receptorantagonisthadthesameeffectsoniNOSNOsystemactivity.CONCLUSION:VIreceptorantagonistmediatediNOSNOsystemactivityincreasesinAVPinducedCFs.VIreceptorantagonistmaybeanewtargetinthepreventionandreversiono

4、fcardiacremodeling.Keywordscardiacfibroblasts;argininevasopressin;argininevasopressinreceptors;nitricoxide【摘要】目的：探讨精氨酸加压素(AVP)及其受体对大鼠心肌成纤维细胞(CFs)诱导型一氧化氮合酶一氧化氮(iNOSXO)系统活性的阻碍.方式：分离培育SD仔鼠CFs,采纳硝酸还原酶法、分光光度法和RTPCR观看AVP及其受体拮抗剂对CFsiXOSNO系统活性的阻碍.结果：AVP显著提高CFsiNOSXO系统活性.VI受体拮抗剂呈剂量依托性地抑制AVP的这一作用，其中1X10-7mol/

5、LVI受体拮抗剂可将AVP诱导下CFs的iNOSNO系统活性抑制到基础状态水平.V1+V2受体拮抗剂具有与VI受体拮抗剂相似的作用.结论：AVP干与下CFsiNOSNO系统活性增强由VI受体介导，VI受体可望成为阻断或逆转心脏重构的新靶点.【关键词】心肌成纤维细胞；精氨酸加压素；精氨酸加压素受体；一氧化氮0引言心肌成纤维细胞(cardiacfibroblasts,CFs)过度增殖和胶原合成份泌过量是心脏重构的重要病理基础，一氧化氮（NO）可通过抑制CFs过度增殖和胶原合成份泌过量抑制心脏重构1-2.精氨酸加压素（argininevasopressin,AVP）能够诱导CFs诱导型一氧化氮合酶一

6、氧化氮（iNOSNO）系统活性增加3,NO合成增多.但AVP如何将这种细胞外信息传递至细胞内，目前尚不清楚.心肌组织有AVP受体表达，AVP受体分为VI和V2两种类型4.AVP干与下CFsiNOSNO系统活性增加由哪一种受体介导尚少见报导.咱们用AVP受体拮抗剂干与AVP诱导下的CFs,观看其对CFsiNOSNO系统活性的阻碍，以了解AVP诱导CFsiNOSNO系统活性增加的信息传递途径，为防治心脏重构提供新的思路.1材料和方式材料实验用SD仔鼠（诞生13d,第四军医大学动物中心）；AVP（美国PeninsularLab）；VI受体拮抗剂、V1+V2受体拮抗剂（Sigma公司）;NO含量和NO

7、S活性测定试剂盒（南京建成生物技术研究所）；TRIZOL裂解液、Oligo（dT）,MMLV反转录酶（Promega公司）;TaqDNA聚合酶（宝生物公司）；PCR引物由上海生物工程公司合成.方式的分离、培育和鉴定无菌条件下取SD仔鼠心室，盐水漂洗后剪至23mm3小块.g/L胰蛋白酶37消化20、40min,搜集细胞，筛网过滤，1000r/min离心.将所得细胞沉淀物悬浮于含100mL/L小牛血清的DMEM培育液中，吹打分散后置于37,50mL/LC02孵箱中贴壁60、90min,差速贴壁法去除心肌细胞.培育细胞长至近融合状态时传代.实验用23代细胞.对CFs进行SABC法免疫组织化学染色：纤

8、维连接蛋白染色阳性，血管滑腻肌肌动蛋白染色阴性，符合CFs染色特点.实验分组实验分为对照组、AVP组(1X10-7mol/L),AVP+V1受体拮抗剂组(IX10-9,1X10-8,1X10-7mol/L)和AVP+V1+V2受体拮抗剂组(1X10-7mol/L).CFs培育至近融合状态时无血清培育液驯化24h,继之分组培育24h搜集培育液测定N0含量和NOS活性，搜集细胞测定iNOSmRNA表达量.每组实验重复3次.含量测定利用硝酸还原酶将N03-还原为N02-,通过比色法测定N02-浓度推算N0含量.操作按试剂盒说明进行.活性测定N0与亲核物质生成有色化合物，通过NOS催化产生的N0量推算

9、NOS活力.操作按试剂盒说明进行.mRNA表达量测定按TRIZOL试剂说明书提取CFs总RNA.反转录合成cDNA第一链，反转录产物进行PCR扩增.其中鼠iNOS上下游引物序列别离为tcgagccctggaagacccacatct和gttgttcttcttccaaggtgtttgccttat,PCR产物为276bp.鼠磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）上下游引物序列别离为tattgggcgcctggtcacca和ccaccttcttgatgtcatca,PCR产物为746bp.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行图像分析，以iNOSmRNA/GAPDHmRXA电泳带荧光强度比值作为iNOSmRNA表达

10、量指标.统计学处置：数据以x±s表示，应用SPSS统计软件对资料进分析.多组均数比较采纳F查验，组间比较采纳LSD法，P<表示不同有统计学意义.2结果及其VI受体拮抗剂对CFsNOS活性和NO含量的阻碍对照组CFs具有NOS活性，能够合成NO.AVP干与下CFsNOS活性显著增强,NO含量显著增高（P<.VI受体拮抗剂呈剂量依托性地抑制CFs的NOS活性和NO含量，其中1X10-7mol/LVI受体拮抗剂可将AVP诱导下CFs的NOS活性和N0含量抑制到与对照组相近水平（P>,图1A,B）.及其VI受体拮抗剂对CFsiNOSmRXA表达的阻碍

11、对照组CFs有iNOSmRXA表达士.AVP干与下CFsiNOSmRXA表达显著增强土，p<.VI受体拮抗剂呈剂量依托性地抑制CFsiNOSmRNA表达Q义10-9mol/L：±1X10-8mol/L：±1X10-7mol/L：±.其中1X10-7mol/LVI受体拮抗剂可将AVP诱导下CFs的iNOSmRNA表达抑制到与对照组相近水平（P&gt图2）.受体拮抗剂与V1+V2受体拮抗剂对CFsiNOSNO系统活性阻碍的比较V1+V2受体拮抗剂与VI受体拮抗剂都可将AVP诱导下CFsiNOSmRXA表达土和土,NOS活性（417±17

12、5和500±183）ukat/L和NO含量（34±14和36土12）umol/L抑制到与对照组土，（450±83）Ukat/L和（29±5）口mol/L相近水平，二者间不同无统计学意义.3讨论AVP是下丘脑分泌的九肽神经内分泌激素，机体许多组织细胞膜上都有AVP特异性受体存在.AVP通过与其特异性受体结合，激活不同的细胞内信号传递系统，发挥不同的生物效应.依照AVP受体后信号传递的第二信使系统不同，将AVP受体分为VI（第二信使为蛋白激酶C）和V2（第二信使为蛋白激酶A）两种类型5,VI和V2受体都有自己特异性的受体拮抗剂.AVP受体拮抗剂是研究AVP生

13、理作用的有效药理工具，心肌组织中有VI,V2两种AVP受体表达6,AVP应该通过其受体作用改变CFsiNOSNO系统活性.咱们采纳AVP受体拮抗剂干与AVP诱导下的CFs,结果发觉：基础状态下CFs有iNOSmRNA表达，具有NOS活性，能够合成必然量的NO.1X10-7mol/LAVP显著提高CFsiNOSmRNA表达，增强NOS活性，增加NO合成；VI受体拮抗剂呈剂量依托性地抑制AVP对CFsiNOSNO系统活性的提高作用，其中1X10-7mol/LVI受体拮抗剂可将AVP对CFsiNOSNO系统活性的提高作用抑制到与基础状态相近；V1+V2受体拮抗剂和VI受体拮抗剂对CFsiNOSNO系

14、统活性的抑制作用相似，说明AVP对CFsiNOSNO系统活性的提高作用要紧由VI受体介导.心脏重构致使心肌收缩力下降、舒张功能消退和心电紊乱，是心力衰竭、心律失常和心性猝死发生的重要环节7.AVP干与下CFsNO合成增加具有重要的病理生理意义.最近几年研究发觉心脏组织自身能够合成AVP8,在心肌梗死、高血压性心脏病、心力衰竭等临床病理情形下，心肌组织中AVP含量显著增高9,AVP含量增高能够诱导CFsNO合成增加，NO合成增加抑制了上述病理情形下CFs异样增殖和胶原合成份泌过量，从而抑制心脏重构.因此，AVP干与下CFsNO合成增加是心脏组织自身对病理性损伤的一种自我爱惜机制.咱们的实验证明V

15、I受体介导了AVP干与下CFsiNOSNO系统活性提高的调剂,提示VI受体有可能成为尔后阻断或逆转心肌纤维化的一个新的作用靶点.【参考文献】1 WeberKT.Awhisperonthewindspawnsastormj.CardiovascRes,2000,46(2):211-213.2 RossiMA,RamosSG,PradoCM.Chronicinhibitionofnitricoxidesynthaseinduceshypertensionandcardiomyocytemitochondrialandmyocardialcollagenremodellingintheabsence

16、ofhypertrophyj.JHypertens,2003,21(5):993-1001.3范延红，赵连友，杨学东，等.核因子KB在精氨酸血管升压素诱导大鼠心肌成纤维细胞一氧化氮合成中的作用J.生理学报，2003,55(4):417-421.4 KaygisizZ,KabadereTE,DernekS,etal.Theeffectsofvasopressininisolatedratheartsj.IndianJPhysiolPharmacol,2001,45(1):54-62.5 ChatterjeeK.Neurohormonalactivationincongestiveheartfailureandtheroleofvasopressinj.AmJCardiol,2005,95(9A):8B-13B.6 ThibonnierM.VasopressinreceptorantagonistsinheartfailureJ.CurrOpinPharmacol,2003,3(6):683-687.7 WeberKT.Cardioreparationinhypertensiveheartdiseasej.Hypertension,2001,38(3Pt2):588-591.8 LuLM,WangJ,YaoT.Chang