miR-449a通过靶定Bcl2调节自噬影响矽尘诱导的肺纤维化

1、miR-449a 通过靶定 Bcl2 调节自噬影响矽尘诱导的肺纤维化矽肺病 (Silicosis)是在生产过程中长期吸入含较高浓度游离二氧化硅(SiO2) 粉尘所导致的以肺部组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病, 在煤碳、冶金、铁道及建材等工业行业中发病率较高, 是我国最严重的职业病之一。大量研究表明矽肺纤维化的重要病理特征为成纤维细胞过度增殖, 成纤维细胞向肌成纤维细胞分化以及细胞外基质 (extracellular matrix, ECM)的过度沉积。矽肺的发病机制尚未完全阐明, 目前无特效治疗方法 , 因此探明矽肺的发病机制 , 对于研究有效的矽肺预防、 诊断和治疗方法十分重要。 近年来有研

2、究表明 ,细胞自噬与 microRNA (miRNA)在肺纤维化发生过程中均发挥重要的作用。自噬作为细胞经典的能量代谢和自我更新机制, 在生物发育过程以及维持机体稳态中发挥重要的作用。自噬发生标志是双层膜自噬小体的形成, 将胞质内衰老的细胞器、蛋白质和生物大分子等包裹, 再与溶酶体融合形成单层膜的自噬溶酶体 , 溶酶体酶对其中的包裹物质进行降解, 为细胞及细胞器的重构、 再生与修复提供原料 , 实现细胞内物质的循环与再利用。越来越多的证据表明 , 自噬在许多人类疾病中发挥复杂的调控作用。其中miRNA通过靶定重要的自噬相关基因, 对自噬的调节发挥重要的作用。miRNA作为一种长度在18-22

3、个碱基的非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA的 3UTR区完全或部分互补结合 , 降解靶 mRNA或抑制其翻译。已有研究表明 ,miRNA可通过抑制自噬相关基因的表达从而调节细胞自噬水平 , 参与许多疾病如癌症、神经退行性病变等疾病的发生发展。目的： (1) 建立矽尘诱导小鼠肺纤维化模型 , 对小鼠肺组织中自噬活性与miR-449a 水平进行检测 , 在成纤维细胞模型中进行验证。明确自噬活性在矽尘诱导小鼠肺纤维化组织中的变化(2) 使用 miR-449a mimic 与转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-1 处理成纤维细胞 , 同时使用agomiR

4、-449a 处理矽肺动物模型 , 来进一步证明 miR-449a 与自噬活性在矽尘诱导肺纤维化发生发展中的关键作用。(3) 结合相关文献报道及生物信息学网站分析, 预测 miR-449a 作用的自噬相关靶基因 , 并对其进行验证。期望从自噬和miRNA的角度揭示矽肺的部分发病机制 , 最终为矽肺的预防、早期诊断与治疗提供线索。方法：(1) 矽尘诱导的小鼠矽肺模型的建立：暴露气管 , 一次性直接灌注Si02粉尘悬液的方式建立小鼠肺纤维化模型, 通过不同时间点 (0 、7、14、28 天) 肺组织病理切片 HE染色观察 Si02 粉尘诱导小鼠矽肺发生发展的动态变化过程。(2)使用 qRT-PCR险

5、测矽尘处理不同时间点小鼠肺组织中miR-449a 的表达改变 ,Western Blots检测自噬标志物LC3与 p62 的改变情况。(3) 使用 TGF- 1 处理成纤维细胞构建肺纤维化体外模型,qRT-PCR检测miR-449a 的表达改变 , 使用 Western Blot检测自噬标志物LC3与 p62 的蛋白表达情况。 (4) 使用 agomiR-449a 联合矽尘构建矽肺小鼠模型, 病理切片 HE染色观察小鼠肺组织的纤维化程度,qRT-PCR检测 miR-449a 的表达改变 , 使用 WesternBlot 检测自噬标志物LC3与 p62 的蛋白表达情况。使用 miR-449a m

6、imic 转染联合 TGF-1 处理 NIH-3T3 与 MRC-5细胞 , 使用Western Blot 检测自噬标志物LC3与 p62 的蛋白表达情况 , 免疫荧光检测 p62 的表达 , 转染 GFP-LC3质粒检测自噬活性 , 同时使用透射电镜观察NIH-3T3细胞中自噬小体数目的改变情况。(5) 进一步通过查阅文献并结合miRDB、 TargetScan 、PicTar 、 DIANA-microT 等生物信息学软件找出miR-449a 的自制相关的靶基因Bc12, 并使用 Western Blot和荧光素酶报告基因的方法进行验证。(6)Western Blot 检测 TGF- 1

7、处理后 ,Western Blot 检测 ERK1/2的磷酸化水平。结果： 1. 小鼠矽肺组织中 miR-449a: 表达下降 , 自噬活性受到抑制：病理切片 HE染色显示 , 在 Si02 粉尘处理的第 7 天, 即可见肺泡内有明显的炎性细胞聚集 , 第 28 天时可见大量的葱皮样矽结节存在, 肺组织广泛纤维化。qRT-PCR检测发现 0、7、14、28 天小鼠肺组织中miR-449a 的水平逐渐下降。使用 Western Blot 检测发现 0、7、14、28 天小鼠肺组织中上皮标志物E-Cadherin表达逐渐下降,I型胶原 (CollagenI)、 - 平滑肌肌动蛋白( -SMA)、纤

8、连蛋白(fibronectin)、波形蛋白 (vimentin)、p62 的表达逐渐增加,LC3/LC3I的比值逐渐下降。说明随着矽肺的发生发展, 小鼠肺组织中 miR-449a 的表达及自噬活性均受到抑制。 2. TGF- 1 可抑制成纤维细胞自噬：miR-449a 的表达：使用不同浓度(0 、1、2、5ng/ml)TGF- 1 处理小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3) 和人正常胚肺成纤维细胞系 (MRC-5)处理 24 小时 , 或使用 2ng/ml TGF- 1 处理 NIH-3T3 和MRC-5细胞系不同时间(0 、 12、24、48 小时 ),发现vimentin、fibronec

9、tin和p62 的表达水平随着TGF-1 处理的浓度和时间而逐渐增加, 而 LC3/LC3I的比值则逐渐下降。使用 2ng/ml TGF-1 处理两种细胞系48 小时后 , 用 qRT-PCR检测 miR-449a的水平较对照组显著下降。说明使用TGF- 1 构造的肺纤维化体外模型中, 自噬活性与 miR-449a 的水平与体内试验的结果一致, 均受到抑制。3. 高表达 miR-449a 可抑制 SiO2诱导的小鼠肺纤维化：在矽肺模型中观察到 ,高表达 miR-449a 组小鼠肺组织病理切片与单纯Si02 处理组相比 , 肺纤维化评分明显降低 , 差异具有统计学意义。 肺组织中的 Collag

10、en、-SMA、fibronectin和 vimentin较单纯 Si02 处理组相比显著下降。自噬标志物 p62 的表达下降 , 而 LC3/LC3I 的比值上升。提示miR-449a 能显著降低肺纤维化的程度, 其机制可能与自噬有关。4. miR-449a 能增加成纤维细胞的自噬活性：体外实验的结果显示 , 高表达miR-449a 之后 ,NIH-3T3与 MRC-5的Collagen、 -SMA、 fibronectin与vimentin的表达均下降, 自噬标志物p62 的表达下降,LC3II/LC3I的比值上升。免疫荧光结果显示 , 转染 miR-449a 后 p62 的表达下降。转染

11、 GFP-LC3质粒后发现 , 高表达 miR-449a 后 NIH-3T3 细胞中绿色荧光斑点数目增加 , 表示细胞自噬活性增加。激光共聚焦实验结果显示, 高表达 miR-449a后 NIH-3T3 细胞内自噬小体的数目显著增加。这些均提示 miR-449a 能增加成纤维细胞的自噬活性。5. miR-449a 通过靶向作用于 Bc12增加细胞自噬：应用多种生物学软件预测miR-449a作用的靶基因 ,发现在 Bc12 的 3UTR区存在 miR-449a 种子序列的结合位点 , 提示 Bc12 可能是miR-449a 的靶基因。进一步用双荧光素酶报告基因实验来验证, 转染 miR-449a

12、后,NIH-3T3 细胞的 Bc12 蛋白水平下降 , 显示同时转染 miR-449a mimic 与 Bc12 野生型质粒后 , 荧光活性较同时转染 miR-449a mimic 与 Bc12 突变型质粒相比显著下降。 提示 Bc12是 miR-449a 的靶基因。6.TGF-1 通过 ERK信号通路抑制Bcl2 的降解： Bcl2 的蛋白水平随着TGF- 1 处理的浓度和时间的增加而逐渐增加。Western blot实验结果显示 ,ERK1/2的磷酸化水平也随着TGF-1 处理的浓度和时间的增加而逐渐增加, 提示 TGF-1 通过 ERK1/2信号通路抑制了Bc12 的降解 , 从而使得细胞的自噬水平受到抑制。结论：在 Si02 诱导的小鼠肺纤维化的发生发展过程中,miR-449a 随着肺纤维化的发展而逐渐下降 , 同时自噬活性受到抑制。高表达miR-449a 后 , 小鼠的肺纤维化受到抑制 , 同时肺组织细胞自噬活性增加, 使用 TGF- 1 处理成纤维细胞构建的纤维化体外