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文档简介

1、- 苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其产酶条件优化 - 苯丙氨酸变位酶属于 MIO-依赖氨基变位酶 (MIO-dependent aminomutase), 可催化 - 苯丙氨酸转化为 - 苯丙氨酸 , 是目前最有效的抗癌药物紫杉醇的重要前体物质。 随着癌症在全球范围内发病率的逐年提升 , - 苯丙氨酸需求量也日益增加。 目前 , 在生产中大量获取 - 苯丙氨酸的方法主要是化学拆分法和 Mannich 反应法等 , 这些方法步骤复杂 , 产物难以纯化 , 生产成本昂贵还会产生有毒有害的副产物。与这些方法相比 , 酶催化法有着高效、 快捷、安全的巨大优势。 - 苯丙氨酸变位酶作为可以高效催化生成

2、 - 苯丙氨酸的生物催化剂受到了越来越多的关注。本研究根据 - 苯丙氨酸变位酶 PAM基因序列设计合成上下游引物 , 利用 PCR技术扩增了目的基因 , 并将其和表达载体 pET-28a 连接 , 构成了表达质粒 pET-28a-pam。将表达质粒转入大肠杆菌表达菌株 BL21 中, 筛选阳性菌株 , 并通过酶切检测在菌株内是否成功转入目的基因条带 , 得到一株基因重组菌。 通过对 IPTG 诱导剂的单因素试验确定了最佳诱导剂含量以及最佳诱导时间 , 并对重组菌进行诱导表达。以 SDS-PAGE手段检测了重组菌的诱导表达并对重组酶进行了纯化。对重组酶的基本酶学性质 pH、温度以及热稳定性进行了

3、研究 , 确定了重组酶的最佳催化 pH为 9.0, 最佳催化温度为 50 , 并对重组酶的热稳定性进行了验证,发现其热稳定性较好。 利用单因素试验和响应面法对重组菌的产酶条件进行了优化 , 确定了最优发酵条件为种龄 :12.8 h, 初始 pH:6.7, 发酵时间 :25.2 h 。在最优发酵条件下 , 重组菌产 PAM最大酶活可达 11.15 U/mL, 较优化前提高了 128.9% 。在 3 L 发酵罐中对重组菌进行扩大培养。 利用单因素试验确定了最佳溶氧为30%。分别比较了未添加任何补料的发酵方式 , 培养 20 h 时流加 30 mL 补料培养基的发酵方式以及培养30 h 时流加 40 mL 补料培养基的发酵方式。确定了补料发酵方式优于未进行补料的发酵方式, 并且对比得到在 20 h 时进行流加补料的发酵方式优于在30 h 时进行补料发酵的方式。以此方式进行扩大培养发酵所得最高酶活

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