细胞工程实验指导书

1、实验指导书课程：细胞工程讲课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培育基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的大体结构、必需的大体设备及其用途与作用方式，把握配制培育基母液的大体技术。二、材料与用具：一、药品：生长调剂类物质、无机盐类、有机化合物等。二、用具：分析天平、移液管、量筒、培育瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。三、教学时数：4课时。四、实验内容：（-）实验室的大体结构及要紧设备：一、洗涤室：水槽、工作分、蒸储水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸镭水制备。二、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培育基的消毒。3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：寄存试剂及器皿。4

2、、预备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各类玻璃仪器、金属仪器等功能：培育基药品称量、配制、分装、灭菌：材料预处置；培育材料的观看分析。五、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。6、培育室：培育架、摇床等功能：培育物的操纵培育。7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。（二）培育基母液的配制:一、MS大体培育基母液：各成份单独称量、单独溶解后混合定容大量元素母液：10倍，1L注意：易与其他成份反映产生沉淀；微量元素母液：100倍，0.5L铁盐母液：100倍，0.5L注意：二者等体积溶解后混合，且需80c水浴lh充分螯合，等待冷却后定容;有机母液:100倍，0

3、.5L母液种类成分规定用量(mg/L)扩大倍数称取量(mg)母液定容体积(ml)配1LMS培养基吸取量(ml)大量元素KNOjNHNOsKH3PoiI900I6503701704401019000165003700170044001000100微量元素h：bo3KI0.830.25100223086062083252.52.550010铁盐NaHDTA1003730278050010有机化合物烟酸甘氨酸肌醇0.51.01001005010010501000050010二、激素类母液的配制:Img/ml的6-BA50ml：先用/L的HCL或NaOH溶解后再加水定容;ml的NAA50ml：先用少量

4、/L的aOH溶解后再加水定容。注：精度要求精准到小数点后三位。(三)培育器皿的洗涤：一、对污染的培育器皿先进行消毒灭菌处置；二、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，寄存于防尘橱内备用。五、实验一、母液相制关记录:备表：母液名称浓缩倍数制备培养基取用量制备日期制备人激素母液名称母液浓度制备日期制备人培养基成分规定用量(mg/L)浓缩(扩大)倍数制备(定容)体积理论称取量(g)实际称取量(g)配1LMS培养基吸取量(ml)二、试剂标签:例:实制与灭一、实验了解MS大量10X100ml/L2008-3-3007园林（1）组

5、验NAA二培育基的配菌ml2008-3-30目07园林（1）组的：培育基灭菌的原理，熟悉培育基的组成和要求，把握固体培育基配制和灭菌的大体技术。二、材料与用具：一、药品：各类母液、琼脂、白糖、NaOH、PH试纸等。二、用具：分析天平、移液管、量筒、电炉、灭菌锅、培育瓶等。三、教学时数：8课时。四、实验内容：(-)培育基的制备：一、按配方要求称好670g/L琼脂放入锅中，加入2/3-3/4终体积的水，加热煮化,一样先用旺火烧开，再用文火煮溶，并注意常常搅拌，避免糊底；二、按配方要求称好15-30g/L糖，待琼脂加热溶化后加入：3、依照培育基配方，依照各类母液顺序和规定量，用移液管吸或量筒取母液，

6、放在烧杯中，待琼脂和糖充分溶解后加入；4、加水定容，并充分混匀；五、用L的HC1或N8H调整PH至规定范围；六、将培育基分装至培育容器内，每瓶培育基深度维持在1cm左右；7、封口，并预备灭菌。(二)培育基的灭菌：培育基分装完后应在24h内灭菌一、打开锅盖，加水至水位线；二、把已装好培育基的培育瓶，连同蒸饰水及接种用具等放人锅内，装时不要过度倾斜培育基，以避免弄到瓶口上或流出，且物品体积不大于锅内整体积的80%：3、盖上锅盖，对角旋紧螺丝，接通电源加热；4、打开平安阀和排气阀排放寒气，至大量白色蒸汽冒出时关闭加压升温，或关闭平安阀和排气阀，当压力升至0.05MPa时，打开放气阀放气至大量白色蒸汽

7、冒出时关闭加压等温；五、当气压上升到12rt时，保持在121-125%之间灭菌20min左右，停止加热；6、由慢到快缓慢排气，当气压回后打开锅盖，掏出培育基，放于无菌空间的平台上冷凝备用。注意：冷空气必需充分排尽，不然灭菌不完全，容易污染；灭菌时刻应依照器皿体积严格操纵，不然易破坏PH值及化学物质，产生有害物质且培育基不易凝固；灭好的培育基不要放置时刻太长，最多不能超过2周。五、实验相关记录：培育基制备表：培养基配方母液名称MS大量MS微量MS铁盐MS有机BANAA母液浓度培养基体积取用母液量（ml）实验三外植体的灭菌与接种一、教学目的：了解外植体灭菌的原理，熟悉无菌空间的灭菌方式，把握外植体

8、的灭菌方式步骤及无菌操作技术。二、材料与用具：一、药品：75%的酒精、95%的酒精、%的升汞（或漂白粉）、无菌水等二、用具：超净工作台、灭过菌的培育基、接种器械（要紧指解剖刀、剪子、锻子等）、酒精灯、培育材料（根、茎、叶或种子等）等。三、灭菌原理：植物外植体都是带菌的，在接种前必需进行消毒处置，通过化学消毒剂灭菌，可在不杀死植物材料的前提下取得无菌材料进行组织养。四、教学时数：4课时。五、实验内容：（-）无菌空间的灭菌：一、按期进行气体熏蒸：（100ml甲醛+5g高镒酸钾）Om。范围，熏蒸后实验室封锁3-5天以避免其对人体产生危害；二、利用之前进行紫外线照射：每次利用前照射15-30min；3

9、、利用之前开动超净工作台：须提早开动10-20min以保证台内的无菌环境。注意：避免尘埃堵塞超净工作台过滤器，并按期检查台面风速：利用之前先将需用物品放入台内，半途不宜拿进，且摆放东西不易太多，尤其不能堆放太高以防挡风。（二）植物材料修剪与预备：一、取材：选取带菌量少且生理年龄较小的母株，采取生长正常、无病虫害的组织材料，除去多余部份，然后将材料整理成适当大小放入烧杯中；二、预处置：先用洗涤剂清洗后再用尼龙网或脱脂纱布覆盖杯口，然后将其置于自来水管下冲洗30-120分钟。（三）无菌操作：于超净工作台内进行一、台面及器械消毒：对台面及人手采纳75%酒精进行擦拭消毒，对无菌操作的器械进行灼烧灭菌，

10、并放于支架上待凉；二、外植体灭菌：于超净工作台内，用709L75%的乙醇处置15-60秒，当即除去乙醇；在烧杯中加入消毒剂（如厥升汞），同时可滴1-2滴吐温，将烧杯振荡或搅拌灭菌处置3-10分钟；弃去消毒液，用无菌水清洗3-4次，每次1-3分钟；将灭菌后的材料置于垫有无菌纸的培育肌中晾干备用。3、外植体的切割与接种：将材料剪成1cm长或切割成1cm二大小左右，依照极性或具体要求接种到培育基上。注意：接种后的培育瓶必需及时放入培育室进行操纵培育，不然阻碍外植体生长。六、实验相关记录：接种一周后，观看接种材料的污染情形，并进行相关记录，分析污染缘故。实验号：总瓶数:日期污染瓶数死亡瓶数萌动瓶数总计

11、瓶数比率（%）实验四马铃薯的茎尖脱毒培育一、教学目的：了解植物茅舍尖脱毒的大体原理，把握马铃薯茎尖脱毒的实验进程及方式，学习运用指示植物法对马铃薯病毒进行鉴定。二、材料与用具：一、材料：带芽马铃薯块茎，指示植物等。二、药品：75%的酒精、95%的酒精、%的升汞（或漂白粉）、无菌水等。3、用具：超净工作台、灭过菌的培育基及培育皿、接种器械（要紧指解剖刀、剪子、镜子等）、酒精灯、解剖镜、光照培育箱等。三、实训原理：植物病毒在寄主植物体内的散布具有不均匀性，茎尖（或根尖）等分生组织不含或很少含有病毒粒子，通过植物分生组织离体培育可取得无病毒植株。另外，某些植物病毒对热不稳固，在较高温度（35-40）

12、条件下会被钝化而失活,其增殖速度会减缓或停止，采取适当的高温处置也可在很少或不损害植物的情形下取得无病毒植株。四、教学时数：4课时。五、实验内容：一、高温预处置：待马铃薯芽长至2cm时,放入38c的光照培育箱中，光照12h/d,处置2周左右。二、材料剪取与灭菌：剪取马铃薯茎尖l-2cm,采纳自来水冲洗，剥去外部叶片，置于超净工作台上进行常规消毒（75%酒精5-15s,%升汞8Tomin,无菌水3-8次），置于消毒过的培育皿中备用。3、茎尖剥离与接种：将已装有消毒茎尖的培育皿置于解剖镜下，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，切取-0.5mm的带1-2个叶原基的茎尖，直立接种到固体培育基上。4、离体培

13、育：通过继代、生根培育等，取得完整植株。五、病毒检测：带根植株通过驯化移栽，取其汁液接种至指示植物千日红或览色藜上，观看其脱毒成效。六、脱毒试管苗的扩繁：对脱毒试管苗进行试管内扩繁，或利用爱惜地进行隔离快繁，取得大量商品植株。六、实验相关记录：接种一周后，观看接种材料的污染情形，并进行相关记录，分析污染缘故。实验号：总瓶数:日期污染瓶数死亡瓶数萌动瓶数总计瓶数比率(%)实验五继代与生根培育(可与实验三互换进行以利于锻炼无菌操作技术)一、教学目的：通过实验，把握无菌操作技术和植物快速繁衍的大体方式和进程，能熟练的进行独立操作。二、要紧试剂和仪器：超净工作台、70%75%的酒精、解剖刀、剪子、镜子

14、、母苗瓶等。三、教学时数：4课时。四、实验内容：1、预备实验所需东西并摆放到位，打开无菌操作室的紫外灯及超净工作台的紫外灯和鼓风机,15-20min后，关闭紫外灯；二、用水和香皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子与鞋子，在关闭紫外灯15-20min后进入接种室；3、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手，把解剖刀、剪子、镒子等器械浸泡在95%酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上待凉；4、取下接种器械，掏出无菌纸；五、打开母苗瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部份都烧到，掏出母苗放在无菌纸上，依照需要进行切割；六、打开新培育基瓶口，把培育材料接入培育瓶，盖上瓶口；7、接种终止后，清理和关闭超

15、净工作台；八、将接种后的培育瓶及时放入培育室进行操纵培育。注意：接种进程中不能说话及随意走动，以避免污染；操作期间应常经常使用70%酒精擦拭工作台和双手，接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上灭菌；接种器械必需凉透才可进行材料切割，不然易烫死烫伤材料；酒精棉球不可带太多酒精，以防烧手；接种时应注意达到无菌操作标准，动作熟，切割准确，散布合理，台面干净。五、实验相关记录：要紧包括污染率、增殖倍数及生长情形等。实验六组培苗的驯化移栽一、教学目的：了解组培苗由室内至室外环境条件的转变，把握生根苗的驯化移栽技术。二、材料与用具：一、药品：多菌灵等消毒杀菌剂。二、用具：镒子、水盆或桶、喷雾器、竹签、栽培基质（蛭石和珍珠岩）、栽培容器（育苗杯、盘）、生根苗瓶、驯化室（温室或大棚）等。三、教学时数：4课时。四、实验内容：一、练苗：将生根的组培苗从培育室掏出，放在自然条件下13天，然后打开瓶口，再放置13天；二、基质灭菌：将蛭石和珍珠岩别离用聚丙烯塑料袋装好，在高压灭菌锅中灭菌20分钟，灭菌后冷却备用；3、育苗杯、盘预备：取干净的育苗杯或盘，将基质（蛭石和珍珠岩按1：1）混合均匀，然后倒入育苗杯或盘中，用木板刮平，将育苗杯或盘放入