结核分枝杆菌耐药基因的鉴定及耐药分子机理的研究

1、结核分枝杆菌耐药基因的鉴定及耐药分子机理的研究结核病是一种古老的疾病,严重威胁着人类的健康。结核病曾在世界上广泛流行,夺去无数人的生命,现在每年仍有上百万人感染结核分枝杆菌。结核病已经成为仅次于艾滋病的全球第二大传染病。但是随着抗生素的广泛使用,甚至滥用,使细菌的耐药问题越来越严重。结核分枝杆菌在长期的进化过程中,形成了多种对抗环境压力的系统。近年来随着多耐药结核菌(multidrug-resistantTB,MDR-TB)和广泛耐药结核菌(extensivelydrugresistantTB,XDR-TB的出现，以及与HIV的共感染，使得并不乐观的结核病疫情更加严重。与其他致病菌相比,结核分

2、枝杆菌细胞壁的特殊结构使其对多种药物具有天然抗性。结核分枝杆菌细胞壁富含脂类,内层主要是分枝菌酸,外层主要是长链的脂肪酸,所以结核分枝杆菌细胞壁对多数亲水的和疏水的抗生素是不通透的。脂类合成缺陷会影响结核分枝杆菌细胞壁的完整性,增加结核分枝杆菌对多种抗结核药物的敏感。抗生素耐药问题已经对全球公共卫生造成极大的威胁。从新的角度研究抗生素的作用机制将会为更好的控制药物耐受提供更好的策略。目前,新型抗生素的开发极其缓慢,以耐药基因作为靶点,开发已有抗生素的增效剂不失为一种权宜之计。增效剂的开发首先是要确实耐药基因及其产生耐药的机理。氟喹诺酮类药物是一类广谱抗生素,在结核病治疗中也发挥着重要作用。细菌

3、蛋白质降解途径在细菌能量循环中具有重要意义,可以作为未来开发新型抗生素的靶位。本课题采用耻垢分枝杆菌为模型构建转座子插入突变库,通过筛选我们获得了一株对莫西沙星超敏感的耻垢分枝杆菌突变株,命名为M371。通过质粒拯救法,我们确定转座子插入在基因MSMEG₃8（88pafC）的第137和138位核苷酸之间。PafC的插入突变会导致耻垢分枝杆菌对氟喹诺酮类药物,包括莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星超敏感;但是对异烟肼、利福平、链霉素、氯霉素、卷曲霉素不敏感。结核分枝杆菌同源基因（Rv2095c）可以回补这一表型。PafC功能缺失菌株对双氧水（H&

4、lt;sub>2</sub>O<sub>2</sub和莫西沙星更敏感。亚抑菌浓度的硫脲和22-联吡啶可以抑制较低浓度莫西沙星的杀菌作用。PafC是氟唾诺酮类药物天然耐药基因。这为蛋白质降解途径作为新药开发的靶位提供了理论依据。转录调控因子在细菌适应环境压力中具有重要作用,尤其是在抗生素压力下。结核分枝杆菌在长期的进化过程中,形成了一套完整的转录因子调控网络。结核分枝杆菌基因组中包含3个IclR家族转录因子，分别是Rv1719,Rv1773c和Rv2989。在本研究中,我们用耻垢分枝杆菌为模型,构建了Rv2989同源基因MSMEG<sub>2<

5、;/sub>386敲除菌株和回补菌株。在正常生长条件下（Middlebrook7H9培养基），MSMEG₂38墓因的敲除并不影响耻垢分枝杆菌的生长。当在3仙g/ml异烟肌胁迫条件下，与野生型菌株相比,MSMEG₂386除菌株的生长明显延迟。在M9培养基中，我们也观察到了同样的现象，而且Rv2989和MSMEG₂386能回补这一表型。在其他抗生素的胁迫下,比如利福平、卷曲霉素、诺氟沙星和乙硫异烟胺等,MSMEG<sub>2</sub&g

6、t;386除菌株与野生型相比，生长没有差异。KatG是激活异烟肌的关键酶，在MSMEG₂3腑除菌株中，katG的转录水平明显升高。酶活测定2果显示，MSMEG₂386除菌株中过氧化氢酶活性明显高于野生型菌株。在巨噬细胞存活实验中，MSMEG₂38敲除菌株存活率明显低于野生型菌株。以上这些结果表明，MSMEG₂38整因通过调控katG的表达参与了异烟肼的胁迫应答,而且IclR家族转录因子可能在细菌氧化压力应答中也发

7、挥着重要的作用。噬菌体作为细菌的天敌,在抗菌方面有其天然的优势。结核分枝杆菌噬菌体SWU是我们实验室前期从来源于四川省的土壤样品中分离得到的，SWU1ffi菌体与L5噬菌体的基因组具有很高的相似性，但是在L5基因组中并没有SWU1gp3的同源基因。用NCBI中的BLAS份析发现在新分离的两株噬菌体EagleEye和Serenity中存在SWU1gp3的同源基因。为了研究gp39基因的功能，我们用pALAC既粒在耻垢分枝杆菌中表达SWU1gp3墓因，命名为WT-pAL-gp39与野生型相比，SWU1gp39勺表达增加了耻垢分枝杆菌对多种抗生素压力和环境压力的敏感性,抗生素压力包括异烟肼、红霉素、

8、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、利福平、万古霉素和氨苄青霉素等,环境压力包括双氧水、高温、低pH和SDS澳化乙锭和尼罗红的吸收实验分析发现SWU1gp3的表达增加了耻垢分枝杆菌细胞壁的通透性。SWU1gp3的表达也改变了细胞内活性氧和NAD⁺/NADI®水平。转录组分析发现SWU1gp39S控耻垢分枝杆菌867个基因的表达。这些被调控的基因大部分参与细菌的重要代谢过程,其中包含多个参与脂类代谢的基因。WT-pAL-gp39t野生型耻垢分枝杆菌细胞壁成分分析发现,在WT-pAL-gp39菌株中短链的脂肪酸大量积累。以上结果表明gp39可能影响

9、了耻垢分枝杆菌的脂肪酸代谢,增加了细菌细胞壁的通透性,从而增加了耻垢分枝杆菌对多种抗生素压力和环境压力的敏感性。抗生素的杀菌实验一般是用对数期生长的细菌与不同浓度的抗生素孵育不同的时间，然后在不含药物的平板上计算CFU的形成。这种方法被广泛应用也被认为是计算细菌存活率的金标准,但是这种方法并不能区分细菌的死亡是发生在和药物孵育的过程中,还是在不含药物的平板上。在本实验中，我们利用在平板上加入抗氧化剂（ROS青除剂）的方法重新检测了ROS&氟唯诺酮类药物致死过程中的作用。传统的实验方法得出的结论是氟喹诺酮类药物的杀菌作用依赖于两条途径,一条依赖于活性氧,另一条不依赖于活性氧。当我们用莫西沙星与氯霉素预处理过的大肠杆菌共孵育,然后在含有抗氧化剂的平板上计算存活率,发现存活率几乎能达到100%。在recA或recB的缺失菌株中,细菌的存活率并不受平板上是否含有抗氧化剂的影响。通过以上实验我们得出结论,氟喹诺酮类药物的致死作用完全依赖于活性氧而且