ISO4833-2003菌落总数的检测方法

1、ISO与美国FDA勺不同处食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）内容提要：l菌落总数检测l大肠菌群及大肠杆菌检测l金黄色葡萄球菌检测l沙门氏菌检测l单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定一一菌落总数的概念l菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。菌落总数测定一一卫生学意义l判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。l及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。l通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。FD

2、ABAM菌落总数测定流程检卞¥xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选才I23个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA35C48±2h菌落计数FDABAM菌落计数方法l选择25250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N也C/（1*n1+0.1*n2）*dl所有平板的菌落数都不足25CFU报告EAPC/ml（g）为25*1/d。EAPC:estimatedaerobicplatecountl所有平板的菌落数都超过250CFU,但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CF

3、U的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。l所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2）,估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为65*100*1/d。l无法计数的平板报告LA（LaboratoryAccident）。l最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。nn-nn菌落总数测定流程检卞X-xg/mL+9xml稀释液(磷酸盐缓冲液)适当十倍稀释样品选才I23个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内(每个稀释度做两个平行)每皿内加入适量(1215mL)平板计数琼脂

4、(PCA),30±1C,72+3h菌落计数l选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下：N也C/(n1+0.1*n2)*dl所有平板的菌落数都不足15CFU计算2平板菌落的算术平均值m,液体卞¥品：NE=m固体样品：NE=rd-1l无菌生长：液体样品：lessthan1;固体样品：lessthan1xd-1l最终结果保留前两位有效数字。菌落总数测定几点说明l由于检样中采用30/35C有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。l鉴于食品检样中的细

5、菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位(colonyformingunits,CFU)报告。菌落总数测定几点要求l每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min,主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。l检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程

6、中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。l检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4C放置，以便在计数检样时用作对照。大肠菌群的定义l大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。l大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）

7、、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠杆菌的定义l大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。l大肠杆菌指革兰氏阴性无芽胞杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MRV-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。l与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETE。、致病性大肠杆菌（EPEC、出血性大肠杆菌（EHEC、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAE。卫生学意义l大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。l食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可

8、能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。l大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCPT理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP施效果的评估指标。大肠杆菌的生物学特性培养特性：l大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、镂盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37C,在42-44C条件下仍能生长，生长温度范围15-46C大肠菌群及大肠杆菌测定MP的检验流程（FDABAM检本5-50g+450m

9、l稀释液适当十倍稀释样品选才I3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL35c,24士2h48士2h有产气管接种EC肉汤没有产气管报告阴性接种BGLB肉汤管44.5士0.5C（水浴培养）24士2h48士2h查MPN1报告结果产气管接种EMB平板（35C、1824h）（大肠菌群）从EM呼板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPN1报告结果（大肠杆菌）大肠菌群测定一一MPN1检验几点说明lMPN检索表：MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增

10、加10倍。l初发酵和证实试验：1 ）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37c分解乳糖产酸产气”。2 ）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。l产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小

11、的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。大肠杆菌测定一一EMB选择性分离鉴别EM呼板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽大肠杆菌测定一一EMB选择性分离鉴别lEMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；l高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；l大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；l该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件大肠杆菌测定一一革兰氏染色基本步

12、骤：l将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min,水洗；l滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗；l滴加95%醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；1 滴加番红复染液，复染1min,水洗、待干、镜检。l结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。大肠杆菌测定一一生化鉴定（表略）金黄色葡萄球菌一一概述l根据伯杰氏鉴定细菌学手册，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）,其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。l金黄色葡萄球菌是人类

13、化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疳、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。金黄色葡萄球菌一一生物学特性金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8心m左右，排列成葡萄串状，无芽抱，无荚膜。金黄色葡萄球菌一一生长特性l金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长金黄色葡萄球菌检验一一方法适用性lMPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。l直接平板计数

14、法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品。l增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。金黄色葡萄球菌检验一一直接平板计数法（FDABAM&ISO）检样（50g+450mL稀释液）适当十倍稀释样品选才I23个连续适宜稀释度吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验）35c,4548h确证试验报告FDABAM金黄色葡萄球菌检验MPN检样（50g+450mL稀释液）适当十倍稀释样品选才I3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管10%NaClTSB肉汤，每管接种1mL35c

15、,48+2h从生长的管中接种1环划线于Baird-Parker平板上35c,48h确证试验报告FDABAM金黄色葡萄球菌确证试验1,凝固酶试验l方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35c培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置35c培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6ho试验中需同时做已知阳性和阴性对照。l结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和3+）的必须进行生化鉴定加以证实。FDA8人帷黄色葡萄球菌确证试验2 .革兰氏染色l对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。3 .

16、生化鉴定l过氧化氢酶试验l葡萄糖厌氧利用试验l甘露醇厌氧利用试验l金葡溶菌酶敏感性试验l耐热核酸酶试验（辅助ISO金黄色葡萄球菌检验一一MPNfe检样（xg+9xmL稀释液）适当十倍稀释样品选才I3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管modifiedGiolittiandCantonibroth,37c,24-48h从变黑或出现黑色沉淀的管中接种1环培养物于Baird-Parker平板上37,48h确证试验报告沙门氏菌属简介l1880年E.Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。l沙门氏菌属是

17、一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽胞杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。沙门氏菌属一一生物学特性形态特征：革兰氏阴性，大小为13X0.40.9am的两端钝圆的短杆菌，无芽抱，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。培养特性：l沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42C都可生长，最适生长温度为37C,最适pH为6.87.8。l营养琼脂平板上：3537c培养1824h,其菌落大小一般为23mm光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。l血平板上：中等大小的灰白色菌落。沙门氏菌属的抗原l菌体抗原（O抗原

18、）l表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原l鞭毛抗原（H抗原）l纤毛抗原FDABAM沙门氏菌检验流程前增菌25g样+225mL乳糖肉汤（肉制品、肉副产品、动物产品）匀质2min,室温放置60±5min混合均匀，测定调节PH6.8±0.235C、24士2h选择性增菌0.1ml+10mlMM（RS1ml+10mlTTB42C、24h（水浴培养）35C、24h43C、24h（水浴培养）含菌量高含菌量低分离培养划线接种选择性培养基（BS、XLDHB35C、2448h（BS）生化鉴定每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个）接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层

19、深4cm）（松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S）35C、24±2h弃去尿素酶试验卫矛醇、富化钾、丙二酸钠、呻喙试验阳性阴性血清学血清学试验一一沙门氏菌的分类报告结果ISO6579沙门氏菌检验流程前增菌25g样+225mLBPW匀质37±1C、18士2h选择性增菌1ml+10mlMKTTn37±1C、24士0.1ml+10mlRVS41.5±1C、24士3h3h（水浴培养）分离培养划线接种选择性培养基（XLD和第二种选择性培养基，如BS）37C、24-48h(BS)每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培养和确认试验37C、24±3h生化鉴定TSI、

20、尿素酶、赖氨酸脱竣酶、0-牛乳糖、V-P、呻喙试验血清学血清学试验一一沙门氏菌的分类报告结果沙门氏菌检验选择性分离培养XLD琼脂：FDABAM-一典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。一一非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。ISO一一中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。菌名菌落形态鼠伤寒沙门氏菌红色，有黑心伤寒沙门氏菌红色，有黑心弗氏志贺氏菌红色大肠埃希氏菌黄色，有胆盐沉淀环粪链球菌-沙门氏菌检验选择性分离培养BS琼脂：FDABAM-一典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围的培养基通常

21、开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有晕环效应；一一非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变色。沙门氏菌检验选择性分离培养HE琼脂：FDABAM-一典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色，中心或几乎全黑色。一一非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。沙门氏菌检验生化鉴定TSI:典型反应：斜面产碱(K):红色；底部产酸(A):黄色；产H2S:黑色(少数不产)沙门氏菌检验一一几点注意l冷冻样品解冻需在45c以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8C,18小时内软化。为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足

22、够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。l进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。测试中应同时接种阳性对照菌株。李斯特菌属简介l伯杰氏鉴定细菌学手册第9版中，李斯牛I菌属有7个种：单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、英诺克李斯特氏菌(L.innocua)、西尔李斯特氏菌(L.seeligeri)、威尔斯李斯特氏菌(L.welshimeri)、绵羊李斯特氏菌(L.ivanovvi)、格氏李斯特氏菌(L.grayi)、默氏李斯特氏菌(L.murrayi)。l单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏

23、菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人的感染。单核细胞增生李斯特氏菌一一生物学特性培养特性：l生长温度为242c(冷藏不能阻止该菌的生长)，最适生长温度为3537c。2025C培养有动力，37C培养动力消失；在显微镜下观察该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运动。l在pH3.84.4仍能生长，在pH中性至弱碱性(9.6)、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。l血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺种血平板可产生窄小的B溶血环。FDABAM单核细胞增生李斯特氏菌检验流程检卞¥25g增菌EB增菌液基础225mL30c4h加入抑菌剂30c2

24、0h选择性分离培养3524-48h30c44h接种。尔口PALCAM接种OX所口PALCAM3524-48h生化鉴定TSA-YE纯培养TSB-YE30c24-48h典型运动过氧化氢酶试验革兰氏染色溶血试验ISO单核细胞增生李斯特氏菌检验流程测试样品(xg或xmL)+9xmL一次增菌培养基(HalfFraser肉汤)30c培养24±2h1mL培养液加入划线接种Oxford琼脂10mL二次增菌培养基中和PALCAM©脂（Fraser肉汤）35c或37c培养48±2h30C、35c或37c培养24-48h划线接种Oxford琼脂和PALCAMC脂30C、35c或37c培

25、养24-48h李斯特菌属的确证：挑取可疑菌接种TSAY需养基过氧化氢酶试验革兰氏染色动力试验单核细胞增生李斯特菌的确证：溶血试验碳源利用试验CAMP（协同溶血）试验单核细胞增生李斯特氏菌一一溶血试验l制备57特血琼脂平板。l挑取TSAYEF板上的典型菌落刺种血平板，刺种时避免接触到平板底部和使琼脂破裂,l单增呈现狭窄、清晰、明亮的Bl西尔李氏菌出现弱的溶血现象；l绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的l英诺克李氏菌不产生溶血现象。单核细胞增生李斯特氏菌一一协同溶血试验（l方法：在羊血琼脂平板上平行接种（R.equi）,在它们中间垂直划线接种可疑菌，板中垂直接种点对溶血环的影响。同时接种阳性（单核细胞增生李斯特氏菌）和阴性（英诺克李斯特氏菌）对照。-溶血；B-溶血；CA