11DNA重组技术的基本工具

1、1.1 1.1 DNADNA重组技术重组技术的基本工具的基本工具抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉思考：思考：自然界是否存在一种生物的自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物进入另一生物的情况？的情况？2.为何原核生物中存在限制性内切酶？为何原核生物中存在限制性内切酶？可能产生了一些特殊的可能产生了一些特殊的酶来防范。可而这种酶能识酶来防范。可而这种酶能识别外来侵入的别外来侵入的DNA并将其分并将其分解，而对自身的解，而对自身的DNA不能起不能起作用。作用。一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离纯化主

2、要从原核生物中分离纯化识别双链识别双链DNADNA分子的某种特定分子的某种特定核苷酸序列核苷酸序列, ,并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开酸二酯键断开. .现在已经从约现在已经从约300300种微生物中分离种微生物中分离出了约出了约40004000种限制性内切酶种限制性内切酶( (限制酶限制酶) )。（Serratia marcesens粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌1234512345 能被限制性内切酶特异性识别的能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺

3、序与另一位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。条链反向读的顺序完全一致。GAAGAATTCTTCCTTCTTAAGAAGCCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCCEcoR EcoR Sma Sma 当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线中心轴线处切开时，产生的是处切开时，产生的是平末端平末端。当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧中心轴线两侧切开时，产生的是切开时，产生的是黏性末端黏性末端。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端平末端平末端催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成E Ecoli DNAcoli

4、DNA连接酶连接酶T T4 4 DNADNA连接酶连接酶1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板分子大小适合，以便提取和体外操作分子大小适合，以便提取和体外操作有有1 1至多个限制酶切点至多个限制酶切点对受体细胞无害对

5、受体细胞无害能在受体细胞中能自主复制能在受体细胞中能自主复制有某些标记基因，便于筛选有某些标记基因，便于筛选 在基因工程中使用的运载体除质粒外，在基因工程中使用的运载体除质粒外，还有还有 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物、动植物病毒动植物病毒等。它们等。它们来源来源不同，在不同，在大小大小、结构结构、复制复制以及以及插入片插入片段大小段大小上也有很大差别。这些基因工程载体上也有很大差别。这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工具，因此将它的作用，就相当于一种运输工具，因此将它们比喻为分子运输车们比喻为分子运输车“。 在进行基因工程操作中，真正被用作载在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过在天然质粒的基础上进行过人工改造的人工改造的。常用运载体：常用运载体： 细菌的质粒细菌的质粒 噬菌体或某些动植物病毒噬菌体或某些动植物病毒ATAGCATGCTATCCATGATAGCATGCTATCCATGTATCGTACGATAGGTACTTAATATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC AATTCGGCATAC GCCGTATG GCCGTATG TCCTAGTCCTAGAGGATCTTAAAGGAT