及CCL5对primeboost免疫策略中抗原特异性免疫应答的增强及

1、Flt3L及CCL5对prime/boost免疫策略中抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用    Answer a fool according to his folly.                   作者：刘春燕, 郑龙, 尤红煜, 张艳, 王俊霞, 宋淑霞Throw away the apple becau

2、se of the core.  【摘要】  目的: 研究Flt3L与CCL5作为联合佐剂在prime/boost免疫策略中对HBc抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用。方法: 将两种细胞因子质粒与携带HBc抗原的DNA疫苗经肌内注射法共免疫小鼠, 免疫3次后再用原核表达的HBc颗粒蛋白或HBc DNA疫苗加强, 观察对稳定表达HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞（B16HBc）的生长抑制作用; 并分别采用MTT法检测荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、 流式细胞术检测脾CD8+T淋巴细胞中IFN表达、

3、 ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清IL2、 IL4含量及乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL杀伤活性。结果: 与对照组相比, 佐剂联合DNA疫苗免疫经蛋白加强组（DDP/Adj）显著抑制肿瘤生长; 佐剂联合DNA疫苗免疫组（DDD/Adj）及DDP/Adj组均可促进特异性淋巴细胞增殖反应（P<0.05）, 且DDP/Adj 高于DDD/Adj组（P<0.05）; DDD/Adj 及DDP/Adj组小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞中IFN表达、 IL2 表达水平及CTL杀靶

4、活性均高于对照组(P<0.01或P<0.05), IL4 表达水平在各组无显著区别（P>0.05）。结论: 在prime/boost免疫策略中, 采用Flt3L与CCL5两种细胞因子联合应用可显著促进荷瘤小鼠产生抗原特异性免疫应答及抗肿瘤作用()。 Knowledge will not be aquired without pain and application.  【关键词】  DNA疫苗; Flt3L/CCL5/佐剂; 小鼠; 抗原特异性免疫应答; p

5、rime/boost策略    Abstract  AIM:  To investigate the immune enhancment   and antitumor effect of the  recombinant plasmids pFlt3L and pCCL5 in DNA prime/protein&#

6、160;boost regimens.  METHODS:  The mice were coimmunized with HBcAg DNA vaccine and the two cytokines DNA constructs by intramuscular injection for three times at an 

7、;interval of 2 weeks. Then the mice were boosted with HBc particle proteins or DNA vaccines,  respectively. The immune efficacy was evaluated by tumor growth curve. 

8、To further investigate the mechanism of inhibiting tumor growth,  lymphocytes proliferation response and the number of IFNproducing cells in splenocytes were measured by MTT o

9、r flow cytometry,  respectively. The levels of IL2 and IL4 in supernatant of splenolymphocyte cultures were measured by ELISA. The CTL activity of splenolymphocyte was de

10、tected with LDH release assay. RESULTS:  Compared with negative control,  DDP/Adj group significantly inhibit tumor growth;  splenocytes proliferation response and the numbers 

11、;of IFNproducing cells in DDD/Adj group and DDP/Adj group were significantly higher (P<0.05 or P<0.01). The levels of IL2 in supernatant of splenolymphocyte cultures in 

12、DDD/Adj group and DDP/Adj group were also markedly higher than that of negative control (P<0.05);  but the levels of IL4 were no differences in all groups (P>0

13、.05). The CTL activities in group of DDS/Adj and DDD/Adj were stronger than that of other groups (P<0.01 or P<0.05). While,  the CTL killing activity in DDS/Ad

14、j group was over that of DDD/Adj (P<0.01 or P<0.05). CONCLUSION:  The significant Th1 response and specific CTL against B16HBc tumor cells are elicited by the 

15、combination of Flt3L and CCL5 in the DNA prime/protein boost strategy.    KeywordsDNA vaccines;  Flt3L/CCL5/adjuvant;  mouse;  Agspecific immune response;  prime/boost st

16、rategy    摘 要  目的:  研究Flt3L与CCL5作为联合佐剂在prime/boost免疫策略中对HBc抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用。方法: 将两种细胞因子质粒与携带HBc抗原的DNA疫苗经肌内注射法共免疫小鼠, 免疫3次后再用原核表达的HBc颗粒蛋白或HBc DNA疫苗加强, 观察对稳定表达HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞（B16HBc）的生长抑制作用; 并分别采用MTT法检测荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、 流式细胞术检

17、测脾CD8+T淋巴细胞中IFN表达、 ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清IL2、 IL4含量及乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL杀伤活性。结果: 与对照组相比, 佐剂联合DNA疫苗免疫经蛋白加强组（DDP/Adj）显著抑制肿瘤生长; 佐剂联合DNA疫苗免疫组（DDD/Adj）及DDP/Adj组均可促进特异性淋巴细胞增殖反应（P<0.05）, 且DDP/Adj 高于DDD/Adj组（P<0.05）; DDD/Adj 及DDP/Adj组小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞中IFN表达、 I

18、L2 表达水平及CTL杀靶活性均高于对照组(P<0.01或P<0.05), IL4 表达水平在各组无显著区别（P>0.05）。结论:  在prime/boost免疫策略中, 采用Flt3L与CCL5两种细胞因子联合应用可显著促进荷瘤小鼠产生抗原特异性免疫应答及抗肿瘤作用。    关键词DNA疫苗; Flt3L/CCL5/佐剂; 小鼠; 抗原特异性免疫应答; prime/boost策略     

19、60;质粒DNA诱导的免疫应答依赖于树突状细胞（dendritic cells, DC）的存在, 抗原注射部位DC的数量及功能状态直接影响免疫应答的强弱1。而在非炎症性的非淋巴组织, DC数量很少, 限制了DNA疫苗的免疫效果。细胞因子Flt3L能够刺激DC细胞的增殖2, 3; 趋化因子CCL5不仅可募集未激活的CD4+记忆T细胞、 刺激CD4+T和CD8+T的活化, 而且参与不成熟DCs细胞的募集、 促进Th1偏移的Th1 型细胞因子（IL2 , IFN）的产生4

20、, 而Flt3L与CCL5协同DNA疫苗的研究还未见报道(医药学/临床医学论文 )。近期的研究结果已证实, 经DNA初次免疫后, 再用不同类型的抗原进行加强免疫的prime/boost免疫策略是一种理想的免疫方法, 该方法诱导的免疫应答是针对不同抗原形式中相同的抗原表位5。我们采用经携带HBc抗原的DNA疫苗初免及原核表达的HBc颗粒蛋白加强免疫的“PrimeBoost”免疫方案免疫小鼠, 同时以真核表达载体pFlt3l和pCCL5作为佐剂, 研究细胞因子Flt3L与趋化因子CCL5联合应用在prime/boost免疫策略中对稳定表达

21、HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞（B16HBc细胞）攻击的免疫保护作用及对携带HBc抗原的DNA疫苗诱导的抗原特异性免疫应答的促进作用。    1  材料和方法    1.1  材料  真核表达载体pFlt3L、 pCCL5、 pHBc 均由本室构建; 大肠杆菌BL21（DE3）及pET28aHBc 重组质粒、 B16HBc稳转细胞(稳定表达HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞)由本室

22、保存; MTT、 ConA为天根公司产品; LDH 试剂盒购自Roche 公司; FITC标记的抗小鼠IFN单克隆抗体（mAb）购自eBioscience公司, PE标记的抗小鼠CD8 抗体购自Invitrogen公司; IPTG 为Sigma产品; BFA为晶美公司产品; 小鼠IL2、 IL4 检测试剂盒购自中晶公司。雄性C57BL/6小鼠, 46 周龄, 由河北医科大学动物中心提供。He that runs fastest

23、 gets the ring.      1.2  方法    1.2.1  DNA疫苗及蛋白的制备及鉴定  (1)重组真核表达载体的制备及鉴定: Flt3L及CCL5基因的扩增与纯化: 参照RNA exregent说明提取C57BL/6小鼠骨髓及ConA刺激的外周血单个核细胞的总RNA, 常规反转录后, 用P1、 P2及P3、 P4引物扩增Flt3L及CCL5全长基因。P1:

24、 5cgggatcctcacaggcatgaggggtccc3(BamH I), P2: 5gctctagagggatgggaggggaggggcacc3(Xba I); P3: 5cgggatccAtgaaggtctccgcggcagcc3 (BamH I); P4: 5gctctagactcatctccaaagagttgatgtac3 (Xba I), PCR产物经鉴定后胶回收纯化。pFlt3L及pCCL5重组真核表达载体的构建: 取经Bam

25、H I和Xba I双酶切Flt3L或CCL5的RTPCR产物和相同内切酶酶切的载体pcDNA3.1/V5His质粒DNA, 16连接过夜, 转化TOPO10感受态细胞, 双酶切筛选阳性重组克隆, DNA测序测定。(2)HBc颗粒蛋白制备: 将本制备的携带pET28aHBc重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）培养于2×YT培养基并培养至A600=0.75, 加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG于37诱导6 h, 离心收集菌体并超声破碎, 然后再次离心得到包涵体。

26、用0.5 mol/L尿素洗1次, 然后用2 mol/L尿素将包涵体溶解, 在变性条件下经Ni2+柱亲和层析纯化HBc蛋白, 按常规方法进行蛋白复性4。将蛋白颗粒吸附到200目铜网, 磷钨酸染色后经透射电镜观察。    1.2.2  小鼠免疫程序及肿瘤接种  将C57BL/6小鼠随机分为4组, 每组5只。第1组（control组）注射pcDNA3.1/V5His空质粒, 第2组（DDD 组）于小鼠股四头肌肌内注射pHBc

27、0;DNA疫苗100 g/只, 第3组（DDD/Adj组）和第4组（DDP/Adj组）注射pHBc DNA疫苗时同时注射两种佐剂pFlt3L及 pCCL5各50 g/只,  DDP/Adj组在本次免疫注射原核表达的HBc颗粒蛋白100 g/只加强免疫。质粒总量为200 g/只, 不足者用pcDNA3.1/V5His补齐, 总体积为150 L/只。免疫程序为0 、 2 、 4、 6周。末次免疫后第4天, 小鼠右腋窝皮下

28、注射0.1 mL  B16HBc稳转细胞 (1×106), 接瘤后第19 天, 按常规方法进行小鼠脾淋巴细胞制备。    1.2.3  淋巴细胞增殖试验  常规无菌分离脾细胞, 并调整细胞密度5×109/L, 按每孔100 L加入96孔细胞培养板中, 分别于试验孔中加入原核表达的终浓度为20 g/L的HBc颗粒蛋白, 同时设未加蛋白的阴性对照, 每组设3个复

29、孔。MTT 法检测淋巴细胞增殖, 用刺激指数（SI）表示细胞增殖活性, SI=A实验孔/A对照孔。You never know what you can do till you.      1.2.4  流式细胞术检测细胞因子INF  常规分离免疫小鼠脾淋巴细胞, 调整细胞密度为 1×1010/L, 加至24孔板, 500 L/孔, 分别加入HBc颗粒蛋白(终浓度10 mg/L)和10 

30、g/L IL2, 每组3复孔, 设不加HBc颗粒蛋白的为对照组。培养72 h , 加入BFA 10     mg/L, 孵育2 h , 收集细胞, 常规流式细胞术检测表达量6。I know no such thing as genius, it is nothing but labour and diligence.      1.2.5  ELISA

31、60;法检测细胞因子IL2,  IL4  常规分离脾淋巴细胞, 调整细胞密度为 1×1010/L, 加至24孔板, 1 mL/孔, 分别加入HBc颗粒蛋白(10 mg/L), 每组3复孔, 设不加HBc颗粒蛋白的为对照组。培养72 h后, ELISA检测细胞因子表达, 按试剂盒说明操作。根据标准品所测A值, 绘制浓度、  A值相关标准曲线。测A492值并参照浓度曲线, 测定表达量。

32、60;   1.2.6  乳酸脱氢酶(LDH) 释放法检测特异性CTL活性  调整脾淋巴细胞密度至1×1010/L, 加入6孔板, 用50 mg/L的丝裂酶素C灭活后的B16HBc细胞与免疫小鼠脾细胞共孵育, 同时加入2万U/L的重组小鼠IL2及10 mg/L的ConA, 于第3天和第5天分别换液, 并补充新鲜IL2。于第7天收集细胞作为效应细胞, 用B16HBc稳转细胞作为靶细胞, 效应细胞: 靶细胞为5

33、01。同时设靶细胞自发释放孔和靶细胞最大释放孔。CTL活性按以下公式计算:    CTL杀伤率=（实验组释放量-自发释放量）/（最大释放量-自发释放量）×100。    1.2.7  统计学分析  采用SPSS10.0统计软件进行方差分析和t检验。      2  结果      2.1  DNA疫苗及蛋白的制备及鉴定 

34、; 提取C57BL/6小鼠骨髓及ConA刺激的外周血单个核细胞的总RNA, 经RTPCR的方法成功地克隆得到708 bp的Flt3L及271 bp的CCL5基因, 与预计编码基因大小一致（图1A）; 将该产物分别克隆到载体pcDNA3.1/V5His, 经酶切鉴定, 电泳结果可见在大约5 500 bp和708 bp处及5 500 bp和271 bp处分别出现2条带, 与预期结果相同; 测序结果显示与GenBank提供的氨基酸序列完全一致

35、（图1B）。SDSPAGE分析结果表明, 携带原核表达载体pET28aHBc的大肠杆菌经IPTG诱导后高水平表达HBc蛋白(图1C)。因该蛋白带有His标签, 经Ni2+亲和层析柱纯化后蛋白纯度达95%以上。经Western blot结果显示, 纯化后的HBc蛋白Mr在21 000出现条带(图1D), 经进一步复性形成了在电镜下可见的大小均匀的蛋白颗粒（图1E）。      2.2  佐剂联合DNA疫苗初免经蛋白加强显著抑制肿瘤生长  以荷瘤鼠为

36、模型, 末次免疫后第4天,  小鼠右腋窝皮下注射0.1 mL B16HBc稳转细胞 (1×106), 接瘤后第19 天, 测量肿瘤体积（mm3）=宽2×长/2。结果显示, control组及DDD组肿瘤体积呈进行性生长, DDD/Adj组和DDP/Adj组肿瘤生长缓慢, 其中DDP/Adj组肿瘤生长最慢, 体积最小（P<0.05）。    2.3  佐剂联合DNA疫苗初免经蛋白加强

37、免疫促进抗原特异性淋巴细胞增殖  免疫小鼠脾淋巴细胞在体外经终浓度为10 mg/L的HBc颗粒蛋白刺激后, 除DDD组的增殖活性（1.014±0.035）外, 其余各组均明显高于对照组（1.223±0.068、 1.398±0.027 vs 1.003±0.012,   P<0.05）; 且DDP/Adj组增殖活性明显高于DDD/Adj (1.398±0.027 vs 1.223±

38、0.068,   P<0.05)。    2.4  佐剂联合DNA疫苗经蛋白加强免疫诱导产生Th1型细胞因子  免疫小鼠脾细胞经HBc颗粒蛋白再次体外刺激后, 诱生细胞因子检测结果见表1, 与空质粒组比, DDD/Adj组及DDP/Adj组脾CD8+T 淋巴细胞中IFN 表达显著增高（P<0.01）; 为了进一步研究Th1型偏移情况, 我们用ELISA方法检测了各组脾淋巴细胞培养上清中IL2、 

39、IL4水平。与空质粒组和DDD组相比, DDD/Adj及DDP/Adj组IL2水平显著增高（P<0.05）, 且DDP/Adj组IL2水平高于其他各组（P<0.05）; 而IL4水平无显著变化（P>0.05）。 表1  脾CD8+T淋巴细胞IFN表达及脾淋巴细胞培养上清中IL2, IL4水平    2.5  佐剂联合DNA疫苗初免经蛋白加强免疫明显提高了CTL活性  本结果显示, DDD/Adj组及DDP/Adj组杀伤

40、效果显著高于对照组及DDD组(P<0.05或P<0.01), 而对照组与DDD组杀靶活性无统计学意义。DDP/Adj组杀伤效果显著高于DDD/Adj组(P<0.05, 图3)。 论文教育信息网      3  讨论    使用细胞因子和趋化因子作为佐剂增加或募集抗原注射部位的DC细胞, 是促进抗原摄取和免疫应答有效的方法7。已有研究者将细胞因子或趋化因子基因与其他一些免疫调节分子基因联用作为佐剂, 如GMCSF

41、0;联合Flt3L 或IL12, 或Flt3L联合MIP 协同核酸疫苗进行免疫, 可有效地募集DC细胞到达抗原注射部位, 获得较好的免疫效果7。研究证实Flt3L和CCL5即是十分有效的免疫调节因子, 同时又具有抗肿瘤作用8, 9。本实验中, 我们成功构建了真核表达质粒pFlt3L和pCCL5, 并制备了表达HBc抗原的真核表达质粒pHBc和HBc颗粒蛋白, 观察了以细胞因子Flt3L与趋化因子CCL5作为佐剂联合应用在prime/boost免疫策略中能否促进HBc抗原特异性免疫应答及抗肿瘤免疫

42、保护作用。    小鼠抑瘤实验结果显示, Flt3L和CCL5联合DNA疫苗初免经蛋白加强免疫在体内显著抑制表达HBc的B16肿瘤生长, 肿瘤细胞接种的第19天, DDP/Adj组小鼠肿瘤体积约为888.5 mm3, 为对照组肿瘤体积的1/5, DDP/Adj组肿瘤体积也明显小于DDD及DDD/Adj组（P<0.01或P<0.05）。上述结果说明, Flt3L和CCL5细胞因子联合应用在prime/DNAprotein/boost免疫策略中可以显著提高机体的抗肿瘤作用。&#

43、160;   T细胞增殖试验结果显示, 细胞因子联合疫苗经蛋白加强免疫（DDP/Adj组）后, 小鼠脾淋巴细胞体外经抗原再次刺激, 其增殖活性明显高于单独核酸疫苗免疫组, 且该细胞增殖活性是抗原特异性的。Flt3L和CCL5联用还可以诱导Th1型细胞分化, 与单独DNA疫苗组比, DDP/Adj及DDD/Adj组均能诱导出针对B16HBc 肿瘤细胞的特异性杀伤, 杀伤率分别为38.7%和30.4%, 均高于对照组 (P<0.01或P<0.05),

44、0;且DDP/Adj组也显著高于DDD/Adj组（P<0.05）。进一步分析荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞IFN、 IL2的产生及CTL活性, 结果与T淋巴细胞增殖结果一致, 而Flt3L与CCL5对IL4的产生并无明显影响。该结果表明Flt3L和CCL5不仅显著促进抗原特异性免疫应答, 而且可诱导T淋巴细胞向Th1偏移。    综合本实验结果和文献报道, Flt3L与CCL5增强DNA疫苗抗肿瘤及抗原特异性免疫应答的可能机制为: CCL5促进不成熟DC浸润, Flt3L诱导DC增殖,&

45、#160;其结果使抗原注射部位的DC数量增加。不仅如此, 细胞因子CCL5还明显促进DC到引流淋巴结的迁移和CD86、 MHC II的表达, 对DC的成熟具有促进作用4。DDD/Adj组、 DDP/Adj组产生的高水平内源性IFN, 可能与Flt3L/CCL5对DC的募集及活化有关。而IFN又可通过提高CTL活性对荷瘤宿主进行免疫调节, 产生了较明显的抑瘤效果。另外, 以往的实验已证实, 荷瘤宿主产生的内源性IFN可通过对肿瘤细胞进行免疫编辑而提高宿主的抗肿瘤免疫10; IFN还可通过影响肿瘤细

46、胞凋亡相关基因Fas及RAIL的表达, 对肿瘤细胞的增殖进行调控11。    总之, 该研究证实应用Flt3L和CCL5两种佐剂提高了DNA疫苗初免的潜能, 比单独DNA疫苗更有效的诱导出抗原特异性的免疫应答, 经蛋白加强免疫后, 诱导出免疫记忆, 较未应用细胞因子初免组产生更强的抗B16HBc细胞的攻击。本研究结果在prime/boost免疫策略中联合细胞因子进行初免的方法将为今后疫苗的发展提供新的形式和理论基础。【参考文献】  1 Sumida SM,

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