反义RNA技术在食品工业中的应用

1、云南农业大学反义RNA技术在食品工业中的应用姓名：李晓莉专业：食品质量与安全班级：2012级食品质量安全1班学号：2012310093指导老师：冯励日期：2014年10月8日反义RNA技术在食品工业中的应用摘要：随着反义RNA的发现及对其研究的深入,反义RNA技术已被广泛应用于食品工业的研究中。本文介绍了反义RNA的概念,并就反义RNA的作用机理和在食品工业领域的应用进行了综述。反义RNA最初在原核细胞中被发现并广泛存在于多类生物中，通过与mRNA互补结合形成杂交链而抑制基因的表达，作用于DNA的复制、转录、翻译的过程，实现对基因表达的调控。反义技术是最近20年来发展的一门全新的基因工程技术,

2、 它是从反向遗传学的角度来认识结构基因的功能和基因表达的调控。反义RNA技术是借助基因重组技术根据碱基互补原理用人工合成或生物体合成的特定RNA片段或其化学修饰物抑制或封闭基因表达的技术。目前人们利用反义RNA技术的这一特点，在食品工业这一领域对生物基因进行有效调控并取得了显著的成就，并且这项技术具有极其广泛的应用前景，也将开辟一个新的领域。关键词：反义RNA技术 基因工程 食品工业 应用Antisense RNA technology application in food industryIndustryWith the discovery of antisense RNA and the

3、 deepening of research, antisense RNA technology has been widely used in the food industry research This paper introduces the concept of antisense RNA and antisense RNA mechanism and applications in food industry are reviewed.Abstract:Antisense RNA was originally discovered in prokaryotic cells and

4、widely exists in many biological, combined with complementary mRNA hybridization to form chain and inhibit the expression of genes, role in the process of DNA replication, transcription, translation, realize the regulation of gene expression. Antisense technology is developed in recent 20 years of a

5、 new genetic engineering technology, it is from the perspective of reverse genetics knowledge structure gene function and gene expression regulation. Antisense RNA technology is with the aid of genetic recombination according to the principle of complementary base with synthetic or synthetic organis

6、m specific RNA or inhibit or closed its chemical membranes.It technology of gene expression. There are the characteristics of antisense RNA technology, in the field of biological genetic food industry for effective control and has made remarkable achievements, and this technology has the extremely w

7、idespread application prospect, will also open up a new field.Key words：Abstract:Antisense RNA genetic engineering food industry application随着基因工程技术的蓬勃发展和代谢调控研究的深入, 反义技术作为一种温和调控的基因工程技术, 开始向世人展示其无穷的魅力。反义基因的概念、分子生物学基础以及作用原理, 对反义基因技术及其在现代植物研究中的应用进行了概述。与基因敲除等功能缺失性研究方法相比, 反义技术具有投入少、周期短、操作简单等优点。反义技术是最近20年

8、来发展的一门全新的基因工程技术, 它是从反向遗传学的角度来认识结构基因的功能和基因表达的调控。本文介绍近年来反义基因技术在食品工业中的应用的研究进展，其中以反应基因技术在植物性食品原料生产，储藏方面的应用为主。反义RNA技术是借助基因重组技术, 根据碱基互补原理, 用人工合成或生物体合成的特定RNA片段 (或其化学修饰物)抑制或封闭基因表达的技术.在食品原料反义RNA 技术主要应用于果实性状及品质的调控,食品原料储藏期的调控。1. 反义技术反义技术是20世纪八十年代提出的一种全新的基因工程技术。它是从反向遗传学的角度认识结构基因的功能和基因表达的调控。根据目前的研究，反义技术可以定义为:根据碱

9、基互补原理，用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)，导入靶细胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA杂交双链，从而抑制或封闭基因表达，使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。2. 反义RNA技术 反义RNA技术是反义技术中一种重要的基因工程技术。它是指能与特定mRNA互补结合的RNA片段。这种反义RNA与mRNA形成1个双体结构，从而阻止mRNA有效翻译。反义RNA一直被认为存在于原核生物中，但1986年，Williams发现真核细胞中也存在天然的反义RNA。目前，实现反义RNA抑制基因表达的方法具体说有3种。第1种是把合成的一段短的反义寡核苷酸直接导入细胞

10、;第2种是将反义RNA与表达载体相连，然后将表达载体导入细胞，实现反义RNA的转录; 反义基因以相反的方向插入到特异的启动子和终止子之间。在转录时其与特异的目的基因片段互补结合。第3种就是RNA干涉。反义RNA可以从复制、转录、翻译等3个水平上发挥功能。在复制水平上，反义RNA可作为DNA复制的抑制因子，它可与引物RNA前体互补结合，抑制DNA的复制，从而控制复制频率。在转录水平上，反义RNA可与mRNA 5末端互补而阻止RNA的转录。反义RNA更主要的调控功能表现在翻译水平上。如在原核生物反义RNA可与mRNA 5端编码区包括SD序列的结合，直接抑制翻译;或与mRNA 5端编码区主要是起始密

11、码子AUG结合抑制翻译起始;或是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构象改变，影响其与核糖体结合间接抑制了mRNA的翻译。在真核生物中反义RNA的调控方式主要有:影响mRNA前体的剪接;影响mRNA前体的转移;影响真核mRNA分子5和3端正常的修饰，如加帽和加尾的修饰等。反义RNA的作用机理被不断地揭示出来，还有人认为，反义RNA会激活RNase H， RNase H专一性降解DNA-RNA杂合双链中的RNA，造成转录过程中尚未从DNA模板上剥离下的RNA链被降解。3. 反义 RNA的作用机理反义RNA被发现后, 其调控机理的研究引起了生物学者的广泛重视.。不同的反义RNA其功能和作用方

12、式不尽相同, 它们可以在基因的复制、转录、翻译等3个水平上发挥功能。反义RNA技术是借助基因重组技术, 根据碱基互补原理, 用人工合成或生物体合成的特定RNA片段 (或其化学修饰物 )抑制或封闭基因表达的技术。3.1 反义RNA的获得反义RNA既可采用重组技术获得, 也可在实验室人工合成。 导入反义 RNA 的方法有2种: 一种是插入法, 通过cDNA文库路线构建反义RNA基因, 通过载体将其插入到受体染色体上, 并随受体基因的表达而表达另一种是注射法, 即将反义RNA直接注射到受体细胞内, 干扰 mRNA的翻译过程, 从而起到短时间的抑制作用。这一方法对那些不能获得稳定转化的, 或是启动子不

13、能有效表达的细胞系统尤为适合。3. 2表达载体的构建利用基因重组技术, 在适宜的启动子和转录终止子间插入一段靶基因, 构成人工反义 RNA基因表达载体.当它引入细胞时将合成反义 RNA。构建表达载体的具体步骤如图 1所示分离信使 RNA (1)作为合成互补DNA链的模板(2), 以DNA (3) 作为有义DNA链的模板,生成双链DNA4. 用内切酶在近启动子区切开质粒 (5). 将双链 DNA 拼接入质粒, 形成表达载体 (7), 当启动子开始转录时, 表达载体将合成原来信使 RNA拷贝, 再用内切酶从表达裁体上切下所加入的 DNA(8), 并以反向插入裁体 ( 9), 转录时表达载体将合成反

14、义 RNA.3.3利用QB复制酶技术扩增利用QB噬菌体的 MDV- 变体 (具有 RNA复制酶的识别和起始序列 )作为载体, 用 RnaseT1将其 63(G)和 64(U)之间切开, 插入外源 RNA片段组成重组 RNA 分子. 将 MDV-的 CDDA与质粒 PBR322组成重组体可以在体外扩增任意长度的RNA分子. 该技术可以在体外高效地拷贝RNA分子序列。3.4体外人工合成直接通过核酸合成仪来合成. 化学合成反义RNA的优点是可以随意设计序列. 缺点是价格比较昂贵, 一般只适用于合成比较小的 RNA分子.4. 反义 RNA 技术在现代作物遗传改良中的应用4.1 利用反义 RNA 技术提

15、高作物的耐储藏性。在植物果实成熟的过程中, 随着呼吸作用的加强和乙烯含量的升高, 果实也发生一系列的物理和化学变化, 包括颜色, 质地等的变化, 使果实容易腐烂变质。为了运输和储藏的需要, 以前通常利用物理和化学等方法抑制果实的成熟, 以减少因果实成熟造成的经济损失。利用反义RNA 技术, 抑制果实组织乙烯的合成, 延缓果实成熟, 可以极大地降低储运成本。4.2 在植物抗病虫中的应用由于病虫害日益严重, 而目前对付病虫害的主要方法是化学农药, 可是化学农药不但严重污染环境, 而且诱导病虫产生抗性, 因此利用生物农药和提高农作物自身抗性逐渐形成共识并成为一个发展方向。利用反义RNA专一性的阻断病

16、毒在宿主细胞中的增殖, 可以增强植物的抗病虫性。从20 世纪80年代, 将编码病毒外壳蛋白 ( CP ) 的基因作为目的基因, 获得转反义CP 的植株, 高效表达的转烟草植株在 TMV 存在时, 能维持抗病毒状态 30d左右, 而正常植株34d便出现病状。这种转CP基因已经在马铃薯,番茄和苜蓿等植物中获得成功。4.3.1果实性状及品质的调控4果实成熟的生理学和分子生物学.果实成熟是指果实生长发育停止后发生的一系列生理生化变化的综合过程,其结果是果实形成典型的外观和食用品质, 如成分、色泽、质地或其它感官属性发生变化。根据果实在成熟期间有无呼吸高峰区, 可以分为跃变型和非跃变型2种类型。跃变型果

17、实在成熟期间出现明显的呼吸高峰,ACC氧化酶和ACC合成酶是C2H4合成途径中的2个关键酶.事实充分证明, 果实成熟是分化基因表达的结果, 果实的成熟受基因调控。目前, 已发现与果实成熟相关的酶和蛋白已有30多种.。果实成熟过程中mRNA 和蛋白质合成的变化及与成熟相关mRNA的cDNA 克隆与鉴定。果实成熟的分子生物学研究, 不仅对揭示果实成熟的生理机制具有重要理论意义。而且为在实践中人为调控这个过程以获得贮藏性好、品质优良的品种奠定了基础。4应用反义RNA技术控制果实成熟通过基因工程培育耐贮藏的新品种, 对促进果品产业健康发展, 满足国内外消费者的需求具有极大必要性。国内外应用反义RNA技

18、术控制果实成熟采用的技术路线概括起来主要有3条, 有的已进入实用化阶段, 有的尚处于研究阶段。一是抑制C2H4合成延缓果实成熟的基因工程，二是抑制细胞壁降解延缓果实成熟的基因工程，三是色素生物合成分子水平操作。4.3.2控制油料种子中脂肪酸的合成植物油脂是主要的食用油. 近年来, 对植物种子中油脂生物合成途径有了较深入的了解, 而且一些在植物油脂代谢中比较重要的基因已被克隆, 为利用基因工程技术改善油脂中的组分提供了便利.利用反义RNA 技术调控油料种子脂肪酸的合成, 获得不同用途、不同品质的植物油, 甚至开发出一些新型的脂肪酸或植物油具有诱人的前景. 目前, Knutzon等已成功地将反义的

19、硬脂酰ACP饱和酶基因导人油菜和芜菁, 转基因油菜种子中的硬脂酸含量由 2% 提高到 40%, 增 加了20倍. 在国内, 石东乔等也在开展这方面的工作, 以期获得高油酸含量的新品系。4.3.2用反义 RNA 技术创造高直链淀粉玉米材料利用反义 RNA 技术调控玉米淀粉的生物合成过程，创造高直链淀粉玉米材料克隆玉米淀粉分支酶（sbe2a）基因片段，以载体pWGLL 为基础，构建高效反义表达载体，通过花粉管通道法将其导入玉米自交系铁7922中。结果获得了4 株转基因株系，GFP 表达检测、PCR 扩增和 Southern 杂交结果表明，目的基因已整合到基因组中，且能够遗传。对4株转基因植株进行

20、RT-PCR 和淀粉分支酶活性检测，结果表明转反义sbe2a玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制，淀粉分支酶活性明显低于野生型，相差最多的降低 79.4%；直链淀粉含量也发生明显的变化，最高的提高了 84.3%，且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。采用反义RNA 技术通过沉默内源 sbe2a，可获得高直链淀粉含量的玉米材料。参考文献1反义 RNA 技术控制果实成熟的研究进展反义 RNA 技术控制果实成熟的研究进展，福建农业大学学报 29(4): 421- 428, 20002反义RNA技术及其在农业领域的应用，辽宁大学学报， 1000-5846( 2005) 04-0328-063 宋艳茹等

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