试验1细胞大小测定

1、细胞生物学?实验养殖： 1 3；生技、海科： 1 6实验一 细胞器的别离、提取与 测量【目的】 掌握叶绿体别离的一般原理和方法，学习用测微尺测量细胞与细胞器大小的测定方法，并了解应用荧 光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。【原理】 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以别离叶绿体， 其别离在等渗溶液 0.35 mol L 氯化钠或 0.4mol L 蔗糖溶液 中进行，目的是为了防止渗透压的改变引 起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r min 离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 r min 离心，可获得沉淀的叶绿体 混有局部细胞核

2、。在室温下进行别离要迅速。用显微测微尺可以直接测量细胞大小，精确度较高。显微测微尺分为物镜测微尺和目镜测微尺 2 种。 目镜测微尺是1块小玻璃圆片可放人目镜内，其大小正好卡人目镜筒内，在圆片正中央刻有 1cm长的直线，直线上均匀分为 100 小格或 50 小格，每小格的长度，随目镜和物镜的放大倍数而变动。物镜测微尺 是一块特制的玻璃载片，载片中央刻有一条1mm长的直线，均匀地刻分为100个小格，每小格为1/ 100mm为10 um，用一小圆形玻璃盖片封盖着，物镜测微尺较目镜测微尺小格的间距精确，通过目镜测微尺测 量细胞与细胞器的大小 小格数，然后换以物镜测微尺校测小格数的精确数值，即为测量的细

3、胞与细胞器 大小结果。某些物质在一定短波长的光 如紫外光 的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在 极短的时间内放射出比照射光波长更长的光 如可见光 ，这种光就称为荧光。假设停止供能荧光现象立即停 止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光 称为自发荧光 ，如叶绿素的火红色荧光。有 的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光称为间接荧光 ，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。【材料】 菠菜叶片。【实验用品 】1 .试剂：蒸馏水，0.35 mol / L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。2 器材：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片

4、，镊子，接种针， 滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管，目镜测微尺，物镜测微尺， 培养皿。【 实验步骤 】1 选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35 mol / L氯化钠溶液45mL中，置人组织捣碎机或研钵中。2 .利用组织捣碎机低速5000r / min匀浆3-5min，或研磨成匀浆。3 .用 6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。4 .取滤液4 mL在1000 r /min下离心2min,弃去沉淀。5 .将上清液在3000 r / min下离心5 min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体混有局部细胞核。6 .沉淀用0.35mol / L氯化钠溶液悬浮。

5、7. 取叶绿体悬液 1 滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察、绘图。8. 将物镜测微尺放在载物台上，校准目镜测微长度：在低倍显微镜下，移动镜台测微尺和转动目镜 测微尺，使两者刻度平行，并使两者间某段的起、止线完全重复。数出两条重合线之间的格数，即可求出 目镜测微尺每格的相应长度。目镜测微尺与物镜测微尺两者重合点的距离越长，所测得的数字越准确。用同样方法分别测出高倍物镜下，目镜测微尺每格的相对长度。计算目镜测微尺每格的长度：例如，测得某显微镜的目镜测微尺 50格相当于物镜测微尺 7格，那么目镜测微尺每格长度为：7X10ym /50=1.4 ym/格。9. 测量510个叶绿体的长轴和短轴

6、，制表格表示测量结果。10. 取菠菜叶片于研钵中，加少量丙酮，研磨匀浆、过滤，滤液置于试管中，顺着太阳光观察，再将 试管避开直射光，比拟颜色的变化。【 实验报告 】1. 绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体形态示意图。2. 用测微尺测量叶绿体的大小后，制表格表示测量结果。3. 记录观察的荧光现象，分析结果。【 思考题 】1 别离叶绿体的实验原理是什么 ?2操作过程中应注意什么 ?实验二 细胞原生质流动的观察【 目的 】 观察植物细胞质中原生质流动现象，了解影响细胞质中原生质流动的因素。【原理】 在多种植物的细胞中都能观察到原生质的流动现象，它是细胞活动强弱的重要指标。细胞原生质流动 现象的产生，是

7、细胞骨架中微丝肌动蛋白与肌球蛋白相互滑动的结果，此过程要消耗能量，受各种因素诸 如温度、渗透压及各种离子的影响。【材料】黑藻也称水王荪、轮叶黑藻 叶，轮藻，洋葱鳞茎 最好使用萌发的鳞茎 或鸭跖草雄蕊花丝或小麦幼 苗的根毛种子在培养皿中湿滤纸上萌发，当根长到12cm,有许多根毛时最适宜。【实验用品】1 试剂： 1mol/L 氟化钠, 1 mol/L 丙二酸钠, 0.17mol/L2,4 二硝基酚 DPN。2 器具：显微镜,载玻片,盖玻片,尖头镊子,刀片。【 实验步骤 】1 取 1 块干净的载玻片,在中央滴 1 2 滴蒸馏水；取紫鸭跖草 或其它材料 花 1 朵,用镊子取 1 枚雄蕊，迅速置载玻片水

8、滴中，切去花蕊，加盖玻片，用显微镜低倍物镜10X进行观察，注意花丝周围附着许多“含珠链状的花丝毛,每 1 粒“念珠是 1 个单毛细胞。2 转换高倍物镜 40X 观察,可以看到细胞质中的颗粒和显著的细胞质,细胞质之间是液泡,内含水 溶性花青素。注意观察花丝毛细胞核的部位,哪一个部位见到细胞质流动,其流动的速度如何。3 用吸水纸吸干水,加 1 滴 1 mol/L 氟化钠,注意观察细胞质停止流动的时间。细胞质停止流动后, 用吸水纸吸去氟化钠,滴人清水,注意流动是否能恢复。4 依上述操作,加 1 滴 1 mol/L 丙二酸钠或 0.17 mol/L 2,4 二硝基酚,注意观察细胞质流动速度 是否发生改

9、变；用吸水纸吸去药液后,参加蒸馏水,再观察细胞质流动的变化。【 考前须知 】 取材时用洋葱鳞片内表皮、鸭跖草雄蕊花丝上的表皮毛、轮藻幼嫩的节间细胞进行的显微观察,如一 时找不到原生质流动的细胞,可将载玻片置于温箱里或白炽灯泡上很短时间提高温度后再观察。【 实验报告 】1 绘制紫鸭跖草花丝细胞或其它材料原生质流动图。2 记录参加各种化学试剂后细胞原生质流动停止的时间,并分析原因。【 思考题 】1、 你如何理解细胞原生质流动原理 ?2、 影响细胞原生质流动的因素有哪些？实验三 细胞骨架的观察【目的】 掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构。【原理】植物细胞

10、用适当浓度的 TritonX-100 处理后，可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护 完好。考马斯亮蓝 R250(Coomassie brilliant blue R250)是一种蛋白质染料，处理后的材料用考马斯亮蓝 R250 染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。【材料】洋葱鳞叶。【 实验用品 】1 试剂：(1) 2% 考马斯亮蓝 R250染色液：称考马斯亮蓝 R250 1g ,溶于250mL无水乙醇中，加冰醋酸35mL再加蒸馏水至 500mL。(2) 磷酸缓冲液 (pH 6.8) ： 6.8mmol/L 磷酸缓冲液，调至 pH6.8。(3) M缓冲液(

11、pH7.2) : 50 mmol/L 咪唑、50 mmol/L 氯化钾、0.5mmol/L 氯化镁、1mmol/L 乙二醇双乙 胺醚、 0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸、 1 mmol/L 琉基乙醇，调至 pH7.2。(4) 1%TritonX-1OO :用 M缓冲液配制。(5) 3% 戊二醛：用 M缓冲液配制。(6) 中性树胶。2 器具：显微镜，烧杯，玻璃滴管，载玻片，盖玻片，镊子。【 实验步骤 】1 .用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮假设干片(约1cnf大小假设干片)，置于50mL烧杯中，参加pH6.8磷酸缓冲液，使其下沉。2 .吸去磷酸缓冲液，用 1%TritonX-100 处理 20mi

12、n。3 .吸去TritonX-100 ，用M缓冲液洗3次，每次5min。4 .用 3%戊二醛固定 30min。5 .磷酸缓冲液 (pH 6.8) 洗3次，每次 5 min。6 . 0.2 %考马斯亮蓝 R250染色10min。7 蒸馏水洗 2 次，然后将样品置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。8 .如果染色效果好，那么可依次用50%乙醇、 70%乙醇、 95%乙醇、正丁醇、二甲苯处理样品，各5min。然后将样品平展于载玻片上，加 l 滴中性树胶，盖上盖玻片封片，制成永久切片。【 实验报告 】 描绘所观察到的洋葱鳞叶细胞骨架图。【 思考题 】1 、 组成细胞骨架的成分有哪些 ?2、

13、本实验制片中， TritonX-100 有何作用？实验四 细胞中多糖和过氧化物酶的定位【 目的 】 掌握细胞中多糖和过氧化物酶的组织化学定位检测方法。【原理】高碘酸 -席夫试剂反响，简称 PAS 反响。主要是利用高碘酸作为强氧化剂，能作用于含乙二醇基的糖，Schiff试剂中的无色亚硫酸品红结合而生成红色化合物的使其碳链断裂而形成乙二醛，氧化得到的醛基与 取代染料而到达定位的目的，见下列图：i OHHMII过氧化物酶体系能把联苯胺氧化成蓝色或棕色产物，反响式如下:F9一亠-AYMY-沁i中间产物联苯胺蓝是不稳定的，无需酶作用即可氧化为棕色。【材料】马铃薯块茎、洋葱根尖或洋葱鳞茎。【实验用品】1、

14、试剂：(1) 高碘酸溶液：高碘酸(HIO4.2H2O)0.4g95% 乙醇35ml1/3mol/L 乙酸钠溶液5ml蒸馏水10ml2Schiff 试剂：取 0.5 克研细的碱性品红于 100毫升沸腾的蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，当染液冷却至50C时过滤，在滤液内参加1NHCI 10毫升。然后放置，使其继续冷却至25C时，再加无水偏重亚硫酸钠或无水偏重亚硫酸钾 1 克，置阴暗处约 24小时后，染液褪至无色或略带淡黄色，然后参加 0.5克活 性炭，用力振荡1min，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，密封保存于4 C冰箱中。可保存数日，用时升至室温，如溶液带红色或紫色，可参加少许无水偏重亚硫酸钠或无水偏重

15、亚硫酸钾，使之再转变为无色时，仍 可再用。0.8克+蒸馏水20毫升+0.2M醋酸钠10毫升+纯酒精70毫升3亚硫酸水：取 200mI 自来水，加 10mI 10偏重亚硫酸钠或无水偏重亚硫酸钾水溶液和10mI1moI/LHCI ，三者于使用前混匀。 4 7 0乙醇。5 联苯胺水溶液：在 0.85盐水内参加联苯胺至饱和为止，使用前参加20体积的 H2O2， 每 2mI 加 1 滴。60.1钼酸铵溶液： 0.1g 钼酸铵于 100毫升 0.85盐水。 2、仪器设备：显微镜，镊子，染色钵，载玻片，盖玻片，吸水纸。【 实验步骤 】1、PAS反响：1把马铃薯块茎用刀片切成薄片；2浸于高碘酸溶液 515mi

16、n；3移入 70乙醇中浸 5min；4Schiff 试剂染色 15min ；5亚硫酸溶液洗 3 次，每次 1 min ；6蒸馏水洗片刻，装片镜检。2、 过氧化物酶的测定：1把洋葱根尖徒手切称 2040微米厚的薄片或用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块；2浸在钼酸铵溶液 5 min；3浸在联苯胺溶液内 2 min 至切片出现蓝色；40.85盐水洗 1 min；5将薄片置于载玻片上展开，盖上盖玻片，镜检。【 实验报告 】 绘图、记录并分析两种实验方法的显示情况。【 思考题 】1. 组织化学的含义和作用是什么 ?2. 过氧化物酶在生物细胞中的分布有何特点 ? 它有何功能？实验五 细胞融合【目的】通过利用P

17、EG法介导鸡血细胞融合的实验操作与融合过程的观察，掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术，为从事细胞工程相关领域的工作奠定根底。【原理】细胞融合 ceII fusion 又称体细胞杂交，是指两个或多个细胞融合形成一个双核或多核细胞的现象。细胞融合可在基因型相同的细胞间进行，也可在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞问进行。基因 型相同的细胞形成的融合细胞称为同核融合细胞或同核体；基因型不同的细胞形成的融合细胞称为异核融 合细胞或异核体。含有两个核的同型融合细胞可通过同步有丝分裂产生含有一个异常大的核的单核子细 胞，其染色体数为正常数的两倍。这些染色体是由原来两个核融合而来的。通过细胞杂交形成的

18、单核子细 胞称为融合核细胞或合核体，即杂交细胞。细胞融合可分为：病毒 如仙台病毒等 诱导的细胞融合；化学物质 如聚乙二醇，即PEG，polyethyleneglycol 诱导的细胞融合；电场诱导的细胞融合；激光诱导的细胞融合。PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞 接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。细胞融合技术已成为细胞生物学、遗传学和医学研究 的重要手段。特别是利用这项技术而开展起来的杂交瘤技术，非常具有实用价值，应用极为广泛。【材料】鸡血【 实验用品 】1 试剂：10.85%NaCl溶液；2GKN液：8.0g NaCI, 0.

19、4g KCI, 1.77g N&HPQ 2HzO, 0.69g NaHP04 H20, 2.0g 葡萄糖，O.OIg酚红，溶于 l000ml 重蒸水中；350 % m/ VPEG溶液： 取50gPEG相对分子质量=4000放入100ml瓶中，高压灭菌 20min。 让PEG冷却至50-60 C,勿让其凝固。 参加50ml预热至50C的GKN液，混匀，置37C备用。4Hanks 原液10 XNaCl80.0gNa2HPO 12H20 1.2 gKCl4.0gKH2P040.6gMgSO 4.7 H 202.0g葡萄糖10.0gCaCl 21.4g称取1.4g的CaCl2，融于30- 50

20、m1的重蒸水中。取 1000ml 的烧杯及容量瓶各一个,先放重蒸水 800ml 于烧杯中,然后按上述配方顺序,逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后,方可参加下一药品,直到葡萄糖完全溶解后,再将已溶解的CaCl2溶液参加,最后加水至 1000ml。 5 Hanks 液：Hanks 原液 100ml重蒸水896ml0.5 %酚红 4ml配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4C保存。 6詹纳斯绿染液。 2器具：注射器、刻度离心管、离心机、血细胞计数板、水浴锅、容量瓶、显微镜,烧杯,玻璃滴 管,凹面载玻片,盖玻片,酒精灯。【 实验步骤 】1鸡血细胞的获得：从家鸡的翼根静脉用注射器采血

21、,注入试管后,迅速参加肝素100U 肝素/ 5ml全血 混合,制成抗凝全血。2 .鸡血细胞储藏液的制备：在抗凝全血的试管中，参加 4倍体积的0. 85% NaCl溶液，制成红细胞 储藏液，置于4C冰箱内可供一周内使用。3鸡血细胞悬液的制备 : 取鸡血细胞储藏液 lml ，参加 4ml 0.85 NaCl 溶液，混匀后， 1 200r/min 离心5min,弃去上清液，再参加 5m1 0.85 % NaCI溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，参加10ml的GKN溶液制成鸡血细胞悬液。4 .计数：取0.5m1鸡血细胞悬液，加 3.5ml的GKN溶液进行稀释，在血细胞计数板上计数。假设细胞 浓

22、度过大，用 GKN溶液稀释至IXI0 7个/ ml左右。5. 鸡血细胞的收集： 吸取1m1鸡血细胞悬液放入离心管中，参加4mlHanks液混匀，I OOOr / min离心5min，弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。6. PEG诱导细胞融合：吸取0.5m1 37 C的50% PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴参加，边加边轻摇离 心管，使PEG与细胞混匀，然后在 37C水浴中静置2min。7. 终止PEG作用：缓慢参加5mIHanks液，轻轻吹打混匀，于 37C水浴中静置5min。8. 制备细胞悬液 ： 用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散, 1 000/min 离心 5m

23、in ,使细胞完全沉降。 弃去上清液,加 Hanks 液,再离心一次,弃多数上清,留少许溶液,混匀。9. 染色和镜检 ： 吸取细胞悬液,在凹面载玻片上滴一滴,参加詹纳斯绿染液混匀,染色3min 后盖上盖玻片,在显微镜下观察细胞融合情况。10. 计算细胞融合率 ： 细胞融合率是指在显微镜的视野内,已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野 内所有细胞 ( 包括已融合细胞 ) 的细胞核总数之比,通常以百分比表示,而且要进行多个视野测定,进行统 计分析。【 实验报告 】画出观察到的融合细胞,并计算融合率。【 思考题 】(1) 试说明细胞融合实验的关键。(2) 细胞融合有哪些实际应用？实验六 细胞膜的通透性

24、观察【 目的 】 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。【原理】 将红细胞放入数种等渗溶液中,由于红细胞对各种溶质的透性不同,有的溶质可以渗入,有的溶质不能渗入,渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压,所以促使水分进入细胞,引起溶血。由于溶质透入速度互 不相同,因此溶血时间也不相同。【材料】 动物新鲜血液。【实验用品 】1 、试剂：0.17moI/L 氯化钠, 0.17moI/L 氯化铵, 0.17moI/L 醋酸胺, 0.17moI/L 硝酸钠, 0.12mo1/L 草酸 铵, 0.12moI/L 硫酸钠, 0.32moI/L 葡萄糖, 0.32mo1/L 甘油, 0.32moI/L 乙醇,

25、 0.32moI/L 丙酮。2 、仪器设备：50mL小烧杯，10mL移液管，试管，试管架。【 实验步骤 】1 、血细胞悬液取50mL小烧杯一只，加 1份血样和10份0.17moI/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液 体,此即稀释的血样。2 、低渗溶液取试管一支，参加10mL蒸馏水，再参加1mL稀释的血样，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血， 使光线比拟容易透过溶液。3 、红细胞的渗透性取试管一支，参加0.17mo1/L氯化钠溶液10mL，再参加1mL稀释的血样，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象 ？为什么？(2) 取试管一支，参加0

26、.17mol/L 氯化铵溶液10mL，再参加1mL稀释血样，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象 ？假设发生溶血，记下时间(自参加稀释血样到溶液变成红色透明澄清所需时间 )。(3) 分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同(2)。【实验报告】将观察到的现象列入表6-1，对实验结果进行比拟和分析。表6-1不同等渗溶液下的溶血现象试管编号是否溶血时间结果分析1 . 10mL氯化钠+1mL稀释血样2. 10mL氯化铵+1mL稀释血样3. 10mL醋酸铵+1mL稀释血样4. 10mL硝酸钠+1mL稀释血样5. 10mL草酸铵+1mL稀释血样6. 10mL硫酸钠+1mL稀释血样7. 10mL葡萄

27、糖+1mL稀释血样& 10mL甘油+1mL稀释血样9 . 10mL乙醇+1mL稀释血样10 . 10mL丙酮+1mL稀释血样【思考题】1、你的实验证明了什么问题？2、在你的实验中，哪些物质容易通过细胞膜？哪些不易？为什么?实验七植物愈伤组织的诱导培养技术【目的】近年来，组织培养作为一种研究技术，已广泛地应用于许多学科中，它不仅对理论研究有重要意义， 并已展现了十分广阔的应用前景。本实验学习植物愈伤组织的诱导培养技术【原理】植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长

28、的细胞，又能重新 分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为脱分化作用，已经 脱分化的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称再分化作用。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸IAA 和6 -苄基氨基腺嘌呤6 -BA 的比例，决定了根和芽的分化。植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织 和器官，最终形成完整的植株。早在1957年Skoog即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。【材料】烟草、花椰莱、胡萝卜、番茄等【实验用品】1、试剂：1乙醇。2IAA 或 2

29、,4 -D。3HgCI 2 或次氯酸钠。46-苄基氨基腺嘌呤6-BA5MS培养基见下表。MS培养基母液配制表单位：mg类 别称取董母事体积ml扩大侑数K1升堵卯墓的啜殿mDKNOj1 90019 0001 65016 500元WSO. THjO3703 7 001 00010100KHjPO1701 70&CaCli * 2HtO4404 400MnSOn! - 4H?O也302 230 ZnSOt 7HiO8.6$60比BOm6. 2$20KI4 33831 00010010NifMoO» 214,06 2525CuSOt 5HiO0- 0252. aCuCL * SHjO0 02525铁Nbj-EDTA37. 253 7251 00010010FeSO八27. &52 785書0100有a 420机0+525500100100.52510050002、仪器设备：培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖