点样微阵列的制备

1、点样微阵列的制备点样微阵列的制备过程包含了一系列简单的移液和点样操作，其中许多变量和因素会影响最终制备的点样微阵列芯片的质量。点样针的选择和安装，点样缓冲液的组成和点样过程的质量控制等是这一过程的关键步骤。研究点样微阵列制备方法的最终目的是尽可能的减小和控制样点间的差异，以获得样点性质均一的微阵列芯片。本节内容主要介绍与微阵列点样有关的设备、试剂和方法，影响接触点样效果的各种变量和因素，以及如何对点样过程进行质量控制以获得高质量的点样微阵列芯片。一、 前言微阵列技术的发展进步带动了生物分析领域一场重大的变革。最初在基因组学研究中开始得到应用的DNA微阵列基因表达分析技术，现在已经发展成为以蛋白

2、质、细胞、生物膜和小分子等为材料的多种类型的微阵列。能使用较少量的试样来实现高通量分析这一显著特性，大大地促进了微阵列技术的发展。相应地，能够适应各种不同用途的具体要求而将上述各种材料排列在特定的支持物上的微阵列制备技术也日益发展成熟。一般地，各种微阵列制备技术首先应该对制备阵列所使用材料的稳定性没有负面影响，能够在阵列制备过程中保持其生化特性上的稳定；其次，阵列制备技术在将阵列材料从容器中转移到制备阵列的表面时，要具有高精度的移液特性，以保证阵列上不同样点之间的均匀性和一致性，并尽可能地减小偏差。当前各种微阵列的制备有两种主流方式：一种方式是依赖于携带有阵列材料的点样针与阵列支持物表面接触点

3、样，将材料转移到阵列中；另一种方式则是将阵列材料喷射到阵列支持物表面。前者由于在技术上相对简单，容易实现，目前已经有多种商品化的点样仪可供选择，并且与之配套的点样针也是种类繁多，有着各自独特的优点和缺点，涵盖了广泛的应用背景。后者实际上是源于现在广泛使用的喷墨打印机中所采用的喷印技术，这种技术在工作时不需要喷咀和阵列支持物表面发生接触，并且可以精确地实现极微量液体的定量转移，因而在越来越多的新型微阵列制备设备中得到了广泛的采用。应用微点样针，通过接触点样方法来制备点样微阵列芯片这一技术在概念上看起来很简单，然而通过点样法制备的微阵列芯片的应用对生命科学研究所产生的影响却是巨大而深远的。上世纪九

4、十年代中期，斯坦福大学布朗实验室的Schena等人，将单根分叉型点样针固定在自制的X-Y-Z机械手装置上，在计算机控制下，将cDNA样品从96孔板转移到经过表面修饰的玻璃载玻片上，这一工作开启了高密度DNA微阵列制备的先河。随后，这一技术受到越来越广泛的关注，许多公司开始致力于研究自动化的点样装置和各种结构的点样针，以便能够以更高密度和更快的速度将纳升，甚至是皮升量级的生物材料转移到用于制作微阵列的支持物表面。在这个过程中，研究和开发人员克服了重重困难，成功地使用实心、中空、和毛细管点样针等，将多种不同类型的生物材料互不干扰地转移到阵列支持物上，排列成高密度的阵列，每个样点的直径一般在几十微米

5、到二、三百微米之间。现在已经有许多商用的、和用户自行定制的点样设备可以用于点样微阵列的制备，在点样制备的DNA微阵列芯片中，用于点样到支持物的DNA材料称作探针，而用于和DNA微阵列芯片杂交的标记样品材料称为靶。固定DNA探针的支持物表面通常是包被了活性化学基团的玻璃载玻片，或者是各种滤膜等。尽管这里讨论的主要是关于如何将cDNA和寡核苷酸探针通过点样固定到支持物表面，所涉及到的影响点样的变量和因素、以及点样的方法和步骤也适用于蛋白质等其他分子和材料的点样。二、 接触点样技术接触点样这一概念反映了在点样过程中，点样材料、点样装置和点样支持物三者之间空间上的连续性。点样微阵列制备时，所使用的点样

6、材料是各种核酸、蛋白质或细胞等生物分子，点样装置则是各种类型的点样针，而点样支持物则是用于微阵列制备的、经过表面修饰的载玻片等。它们各自的一些物理和化学特性决定了三者之间的相互作用，并与周围的环境因素如温度、湿度、以及点样装置的运动参数，如点样针运动速度和点样针与支持物的接触时间等，共同决定了每次点样过程转移的生物材料的体积和在支持物上形成的样点的形状。其中比较关键的特性有点样材料的粘度和表面张力、点样阵的制作材料和几何形状、以及点样针和点样支持物的疏水特性。此外，在高密度的微阵列制备中，由于需要反复多次将不同的材料分别点样到微阵列中不同的位置上，因此同一根点样针在每次更换点样材料之前要进行彻

7、底的清洗，以完全除去点样针上残留的现有点样材料，重新加样和开始新一轮点样循环。点样针的清洁也是决定所制备微阵列质量和实验结果可靠性的重要因素，如果每轮点样之间，同一根点样针的清洁不充分，就会将点样针上残留的、上一轮点样时使用的点样材料直接带入到下一轮所点样的新样点中，造成交叉污染，这对随后使用微阵列进行的样品检测而言是毁灭性的打击。接触点样中样点的形成过程点样开始时，首先是点样针浸入装有点样材料的容器进行加样，这里点样针的浸入深度和在点样材料中的停留时间非常重要。如果点样针浸入过深，会携带过多的样品，这样使用实心针点样时形成的样点尺寸过大，而使用分叉点样针点样则会使得最初的数个样点尺寸过大。不

8、仅如此，粘附在点样针表面的过多点样材料有可能被带入后续的点样过程中，造成交叉污染。在对分叉点样针或者毛细管点样针进行加样操作时，点样针的浸入时间要足以保证用于储存点样材料的狭缝或毛细管结构被样品材料完全充满，并且在开始点样前要进行预点样，以避免最初得到的几个不均匀样点对所制备点样微阵列芯片质量的影响。接触点样的第二个步骤是点样针与支持物表面的接触和将点样材料转移到支持物上，形成样点，如图1中所示。这里有一些关键的参数会影响到点样时转移样品材料的体积，以及形成样点的几何形态。首先，点样针与支持物接触时的力量，或者说速度是关键性的因素之一，尤其是在使用分叉点样针或毛细管点样针的情形下，因此需要对点

9、样仪中机械手装置的Z轴减速过程进行精确控制。一旦点样针与支持物表面发生接触，点样针本身的直径、针尖表面的形貌和支持物的表面特性共同决定了点样针和支持物表面之间缝隙的形状、毛细张力的大小、针尖和支持物之间存在的点样材料的量、被挤出针尖区域以外那部分点样材料的量。通常由于毛细张力的作用，一部分点样材料溶液被保持在针尖和支持物之间，同时还有部分点样材料溶液稍微超出针尖的周长范围以外，这些点样溶液中最终有多少会留在支持物表面的样点中取决于点样针在支持物表面的停留时间、点样针离开支持物表面时在Z方向上的回缩速度、点样材料溶液的粘度和表面张力，以及与支持物表面的接触角。对于接触角很大的情形，点样时留在支持

10、物表面的液体先是随机地回缩，这一过程中仍然残留在点样针下端的液滴被拉细成液体线，并在所伴随的液体蒸发作用下使得针尖和支持物之间的液体线断裂而完全分离。如果此时针尖下方液滴回缩过快，液体线会发生不均匀的断裂，这时飞溅出的液滴会在支持物表面所点样的样点周围留下数个微小的“卫星”样点，并对阵列中正常点样的其他样点产生污染。图1 接触点样过程中点样材料的转移和样点形成过程。图中从左到右，依次显示了使用250微米实心针，将点样材料转移到环氧硅烷修饰的支持物表面的过程，转移液体的量大约为2 nl。从图中可以看出，点样针上的液体并没有被全部转移到支持物的表面，大约有5液滴在点样针回缩过程中留在针尖表面。假定

11、在点样过程中，所有环境因素、表面特性和机械参数可以保持一致，那么点样时所转移点样材料的量主要取决于点样材料的成份和浓度，因此这就要求加样板中点样材料的浓度和加样时的浸入深度保持恒定。点样材料转移到支持物表面以后，最终得到的样点形态主要取决于点样溶液在支持物表面的蒸发速率、接触角和其化学组成。点样支持物的影响接触点样所要求的理想支持物表面应该是平整的、并且具有均一性的包被。目前DNA点样微阵列制备中使用最为广泛的支持物是表面通过硅烷化反应衍生了氨基或醛基的载玻片。玻片的这类硅烷化修饰反应已经是广泛使用的技术，但是如何最终得到大量修饰均一、可重复性好、性能稳定的点样用玻片支持物仍然是一个挑战性的工

12、作。为了提高点样过程中每个样点中所包含的点样材料的量，以增强芯片表面的反应信号；以及提供一个类似于溶液相反应的环境，以利于发生在芯片支持物表面的各种生物分子相互作用过程，如核酸杂交、免疫相互作用和配体与受体分子结合等的进行，最近发展起来的一些技术通过在玻片支持物表面修饰上一层聚丙烯酰胺、聚乙二醇等材料形成的三维凝胶状结构薄膜，并在这种表面上制备点样微阵列芯片。这种三维修饰结构提供了更大的表面积，而且使得刚性的支持物表面也具备了类似尼龙膜的芯吸效应（wicking effect）。这些改变对支持物表面性质的影响是巨大的，它使得在同样尺寸的样点中可以容纳更多的点样材料。控制软件和数据跟踪软件控制部

13、分是接触点样系统的关键组成部分之一。它们提供了图形化的工作界面，使得用户可以设定、管理、监控、记录和跟踪点样操作过程，并对影响点样过程的关键变量和参数，诸如微阵列芯片上的样点间距、点样针预点样样点数量、机械手Z轴运动控制参数、点样针加样和点样时的停留时间、点样针清洗和干燥的操作顺序等进行调整。更为广泛的软件设定包括了样品跟踪功能模块，使得阵列上的样点位置可以和加样板上板孔内的样品之间建立起对应关系。如果将样品跟踪软件与数据库管理软件进行集成，就可以使得实验者能够迅速设计微阵列实验，并在得到结果以后反过来对微阵列实验的设计和点样过程进行优化。在许多点样仪控制软件中，还集成了质量控制功能模块，使得

14、用户可以实施监控点样的质量，并及时发现点样过程中可能会出现的差错和进行修改。与接触点样技术不同，后面将要介绍的非接触式点样技术，或者更为确切地称为喷样技术，由于不需要喷咀和基底之间直接接触，因此在点样过程中，点样材料、点样装置和点样支持物三者之间在空间上是不连续的。这种不连续性带来的好处是减少了对点样过程的影响因素，因此与接触点样相比，喷样针每次转移材料的量可以控制得更为精确、重复性更好，而且在支持物上形成的样点形态更加均一。然而，由于这种非接触式点样技术中使用的喷样针在结构上一般较为复杂，要使用到螺线管、或是压电装置等来驱动微量液体的分配和转移，因此非接触式点样装置要比接触点样装置在装置结构

15、上更为复杂，价格也更为昂贵。三、 点样设备和操作点样微阵列芯片的制备过程如图2中所示。图2 微阵列的点样过程。点样仪中硬件部分主要包括机械手控制装置、点样头、点样台、在更换点样针上的点样材料之前对点样针进行清洗和干燥的装置、环境控制部件以及加样多孔板和点样支持物玻片的加载和固定装置。图3中给出的照片是UC Berkeley的Ngai实验室自制的点样仪。此外，点样仪还必须配备相应的控制和操作软件。图3 UC Berkeley的Ngai实验室自制的点样仪。左图是整个点样仪的外观，右图是点样头的局部放大。机械手装置控制整个点样过程通过简单的机械手装置来实现，通常是三轴的笛卡尔坐标系形式。X和Y轴的控

16、制精度要求较低，一般使用长行程的滚珠丝杆或导螺杆作为运动轴。当然，现在许多点样仪中也使用了高速、高精度的直线电机作为运动轴。直线电机比传统的丝杆传动系统要昂贵很多，但是它在速度、加速减速，和运动精度等方面能提供更多的优点。点样仪的垂直轴或Z轴通常使用高精度的导螺杆作为运动轴，但是对行程的需求相当地小。一般典型的样点尺寸在100到200个微米。在支持物上点样所能获得的样点密度首先取决于样点的直径，同时，点样仪机械手装置的X和Y轴的重复性和定位精度也会影响到点样的密度。点样仪中使用的普通机械手装置精度一般在数十个微米，如果需要制备高密度点样微阵列芯片或者是长时间连续运行点样仪，那么机械手装置的精度

17、要在数个微米，并且具有闭环运动控制，以减小系统误差。同时，机械手装置Z轴的垂直定位、以及速度和加速与减速控制在接触点样中也需要精确控制。点样台在点样仪中，用于点样的玻片等支持物通常是排放在一个大的平台上，有时也称作点样台。取决于所设计的点样台一次装载和点样玻片的数量，点样台通常与点样仪机械手装置的X或Y轴独立相连，或者是同时与X和Y轴相连。通常点样台一次可以装载20到300张点样用的玻片。大型的点样台可以提高点样芯片制备的通量，并且可以更加经济的利用点样的DNA探针等材料。随着点样台面积的增大，平台表面的平整度和点样过程中可容许的机械误差都会下降，这就使得同一批点样制备的大量点样微阵列芯片中样

18、点之间的均一性随之变差，因此对于具有大型点样台的点样仪而言，更需要对机械手装置进行精确的调校和日常维护。点样头点样头是点样仪中最为关键的部件，用于点样的点样针就安放在其中，通过点样头将点样针与机械手装置的Z轴相连。点样针通常以“悬垂”的方式装配在点样头中的套管内，利用其自身的重力进行垂直定位，并有相应的机械限位结构防止滑脱，但是仍然保持点样针在与支持物表面接触时可以在垂直方向上自由向上运动。这种设计的最大优点在于可以缓冲点样针与支持物表面接触时的冲力，避免点样针尖端的磨损和对支持物表面的损伤，提高点样针使用的耐久性，并使得同一根点样针点样的样点具有较好的均一性。装配点样针的套管是点样头中的关键

19、结构，它应当具有合适的紧精密度容限，使得点样针偏离垂直方向的角度尽可能的小，同时要留有足够的间隙以避免点样针与套管结合过紧而无法在套管内垂直滑动。Telechem的Stealth点样针上设计有一个轴环，用于防止点样针在点样头中发生旋转，可以消除点样针自身旋转带来的与支持物表面之间的摩擦力，改善点样的性能。此外，点样针制作材料的选择也很重要，应该选择可以防止静电在针尖和点样头上积累的材料，因为在点样过程中静电的累积会严重影响到所点样阵列的质量。由于在接触点样过程中点样针必须与点样支持物表面接触，因此点样头在设计上必须提供一定的柔性，以防损伤点样针，或者是点样支持物的表面。在点样针完成与点样支持物

20、表面之间的接触点样过程后，点样针还必须要能够回复到其最初的位置。为了达到这一目的，点样针的安装上通常使用压缩弹簧、重力、或柔性泡沫等可以向点样针一端施加向下运动力量的材料。点样针的机械加工是一个非常精密的过程，并由此得到极细的点样针针尖。在包含有多根点样针的点样头中，有时需要对点样头中个别点样针进行更换，这时应该选择与原来点样针相匹配的新点样针，以减少因点样针性能差异而导致的点样阵列质量差异。随着点样头中点样针数目的增加和点样台上装载玻片数量的增多，维持点样头与点样台平面间的平行变得困难，此时不仅要选择合适的点样针，还应当通过机械的方式对两者的平行关系进行调节，以获得优良的点样质量和延长点样针

21、的使用寿命。在一些点样头中，可以包含4根点样针，以2×2的阵列排列，或是12根点样针，以2×6的阵列排列，点样针之间的中心距为9毫米，这与常用多孔板的孔间距是一致的，适合使用标准的96孔板加样。在使用384孔板加样时，常见的点样头中一般包含了16、32、48或64根点样针。点样头一般设计为4×4，4×8或 4×12的点样针阵列，中心距为4.5毫米，这样在点样时就可以使用满足SBS标准的384孔板来为点样针进行加样。为了进一步提高加样和点样的通量，现在也有点样头中将点样针间距设计为2.25 mm，以便使用1536孔形式的多孔板进行加样。通常点样头

22、中采取以上这些排列方式的一个原因是考虑到常用的玻片支持物表面可用与点样的区域一般为22×60毫米，其余空白的玻片边缘区域要留作贴写标记和在使用时将玻片在杂交室中固定。在使用单根点样针进行点样时，很容易保持微阵列芯片上所点样的样点与加样多孔板中样品之间的相对位置。使用多根点样针同时点样时，由于点样头中点样针的固定排列方式，以及加样板和所点样阵列之间的排列差异，这种直接的对应关系不复存在，为此需要有样品追踪软件能够记录下阵列上各个位置的样点所对应的样品，这在处理大量样品时是极其方便和必要的。点样针清洗系统由于需要在点样过程中为点样针更换点样材料，因此在给点样针更换材料前的清洗和干燥对于获

23、得稳定的点样特性和避免不同点样材料间的交叉污染至关重要。点样针的清洗操作可以使用超声水浴或者是循环水浴的方式，也可以将两者结合使用。点样针的干燥一般是使用真空装置从点样针上抽吸去残留的的水分。装配有点样针的点样头是接触式点样系统的核心，点样仪中的其他组成部件和点样时的环境因素对点样针的可靠性和重复性有着直接影响。对点样仪各个部件的状况进行监控、维护、校准和调节有助于获取最佳的点样性能。环境控制一旦点样针完成加样，这时样品溶液的蒸发效应就开始对点样针上暴露于气液界面的点样材料产生影响，使得点样针中点样材料的体积和浓度不断变化。实心点样针对这种蒸发现象最敏感，但即使是分叉点样针，其中所包含的点样材

24、料体积也会由于蒸发而越来越少，使得在后续点样的样点中所转移点样材料的量不断减少。不仅如此，加样板中点样材料的蒸发也必须得到有效控制。一旦加样板在实验室环境下暴露的时间过长，每个板孔中点样材料的浓度会随着液体的蒸发不断升高，并且由于不同板孔蒸发速率的差异会引起不同板孔内点样材料浓度的差异。此外，点样到支持物表面点样材料的蒸发速率也会影响到最终形成的样点形态。因此，在商品化的点样仪中，一般都采用密闭的点样环境，使得环境中的相对湿度恒定在55-70。在制备高密度点样阵列时，最好将加样板也放置在冷却的环境下，以防止大量样品蒸发引起的点样材料间的巨大差异。在使用蛋白质作为点样材料时，还需要控制点样台的温

25、度，以保持点样到支持物表面的蛋白质的活性，防止其变性和促进蛋白质分子在支持物表面的固定。由于点样制备的样点尺寸一般在数百微米，空气中悬浮的粒子和灰尘等对微阵列芯片的质量会产生很大影响，这些杂质或者是沉积在支持物表面的样点上对表面张力产生影响，直至影响样点最终形态，或者是堵塞点样针的狭缝，破坏其性能，直至无法点样。此法，这些粘附在支持物表面的污染物往往在可见光范围内有较强的荧光和散射特性，如果在后续的芯片反应和清洗中不能被清除掉，会对芯片的检测和成像产生很大影响。为点样仪配备空气净化装置，通过过滤除去空气中的带电粒子和悬浮物，以及使用可以抗静电的材料对于避免上述污染物对点样仪中的影响是行之有效的

26、，有助于点样微阵列制备质量的改善。四、 点样针技术在微阵列技术发展的初期，布朗实验室和其他一些研究人员使用单一的点样针来制备微阵列。随着技术的发展和研究的需要，迫切需要制备更高密度的微阵列，这就促进了能够同时向阵列支持物中更多的位置上，更快地进行点样的点样针和机械手装置的发展。下面逐一介绍各种类型的点样针。实心针实心针是结构上最为简单的点样针。单根实心针的外观为圆柱形，一般使用不锈钢、钨或者钛等金属材料制备，用于点样的一个端部被加工成非常精密的针尖。在点样过程中，实心针每次所转移液体的量和所形成的样点形状都有很好的重复性。只要在每次为点样针更换新的点样材料之前，对实心针进行正确的清洁，避免与前

27、次点样时残留的点样材料之间发生相互的交叉污染，就能够应用实心针点样制备得到理想的微阵列芯片。由于实心针比其他各种类型的点样针在结构上都要简单，因此也是最易于清洁的点样针，并且不像其他点样针那样容易发生残留探针的污染和点样针被堵塞等问题。此外，实心针还能够较好地耐受点样过程中点样针运动时引起的冲击。通常实心针每次加样后只能点样一个样点，需要重新加样后才能够继续进行点样过程。每次点样时转移液体的量取决于针尖的尺寸，直径越大，每次转移液体的量越多，在阵列支持物上形成的样点直径也越大，所制备阵列的样点密度就越低。与所有其他类型的点样针相比较，使用实心针点样时对点样材料的利用效率最高，样品浪费不会超过1

28、5，而且每次转移液体的量和所形成样点在形态上也很均一，样点尺寸的变异系数一般不超过2。但是，实心点每次点样完一个样点之后需要重新加样耗费了大量时间，因此该点样针最大的不足之处在于其点样的速度较慢，通量不够高。为了提高使用实心针点样的速度，相应的机械手装置中可以使用装配了多根实心针的点样头，这样就可以使用多根实心针同时进行点样操作。在应用多根实心针同时点样时，点样头所包含点样针阵列中不同点样针之间的性能差异是决定所制备阵列质量的一个关键因素。一般而言，需要挑选直径和表面性质一致性较好的点样针来装配同一个点样头，以使得在所制备的点样微阵列中，来自不同点样针所点样得到的样点具有较好的一致性。不仅如此

29、，随着点样针阵列中点样针数目的增加，点样针之间的差异也逐渐变得显著起来，而且在点样过程中个别点样针出错的风险也会升高，因此在实际使用中为每个点样头所装配点样针的数目是有一定限制的，要综合考虑点样的通量和质量，以及更换个别点样针对整个点样过程的影响。微加工点样针阵列Corning公司使用硅材料制造的点样板是一种高并行性的点样装置，它通过腐蚀的方法在硅材料表面得到超过1000个柱状结构，直径为100微米，并以阵列的方式排列。这些柱状结构可以和一个存储有点样材料的漏斗状样品池的形状相匹配。操作时，点样板上的全部微柱同时分别插入漏斗末端与之匹配的各个沟槽开口，并在回缩时携带数皮升点样材料，随后的点样操

30、作将材料从点样板的微柱上转移到支持物表面。这种并行点样方式的优点是阵列上样点之间的距离由点样板上微柱之间的空间定位决定，而不受点样时机械手的位移误差影响，因此样点定位精度非常好。不仅如此，在使用这种点样板点样制备的微阵列中，每次转移点样材料的体积和所得到的样点尺寸的变异系数小于9，点样材料的浪费不超过15。然而，应用这种微加工点样针阵列需要非常昂贵的专用点样设备。在该设备中制作阵列的点样支持物（通常是载玻片）被设计成在点样板和漏斗状样品池之间移动，这样就使得每轮点样操作循环时机械手的移动距离最短，从而提高了点样板加样时的速度和点样的通量。针和环Affymetrix公司研制的点样仪是唯一使用针和

31、环结构装置来进行点样的。图4中给出了针和环点样系统的工作原理。在点样开始时，首先将一个微型环状装置浸入要点样的材料中，在表面张力作用下，取出环后点样材料会在环内形成一层液膜，薄膜的中央区域较厚，并逐渐向边缘减薄。这时将携带了液膜的环移动到点样支持物中欲点样位置的上方，然后让一根实心针穿过液膜中央，这时实心针的端面会从液膜中粘附少量点样材料，并在高度继续下降与点样支持物表面发生接触时将材料转移到支持物的表面。在环上液膜较厚时，实心针的运动不会导致液膜结构的瓦解，因此环上的液膜可以作为样品的临时储存库，反复进行多次点样而不需要在每次点样前都使用环去重新加样。由于一次加样后，在进行连续点样时环中所储

32、存点样材料的量会随着使用而逐渐减少，液膜的厚度也会相应地逐渐变薄，实心针每次穿过液膜后粘附点样材料的量也在减少，所以每次点样到支持物上样品的量也在发生微小的变化，这就使得在应用这种点样方式制备的微阵列上，样点形态与单纯使用实心针点样时相比较，尺寸变异较大，并呈现出逐步减小的趋势。使用针和环结构装置进行点样的最大局限性在于点样操作易受环境因素，特别是湿度和温度的影响，导致环中储存点样材料溶液的蒸发和环上液膜稳定性的改变。不仅如此，在给环结构加样时，盛放样品的容器中需要有较多的液体，以便使得整个环结构能完全浸没其中，这就造成了样品容器中最终会残留较大的死体积而不能用于环的进一步加样，这部分样品会被

33、浪费掉；在点样过程中随着环中储存液体的消耗和薄膜厚度的减小，最终会使得薄膜结构发生瓦解，这时薄膜破碎前残留的样品同样会被浪费掉。这对于样品数量很少或者是样品来源很珍贵的情况而言，针和环装置是一种非常不经济的点样方式。例如，给环加样时，样品容器中一个典型的加样体积需要1.5 ml的样品溶液，点样时每个样点上转移的液体为40 pl，这样在每张载玻片上使用该点样材料重复点样4个样点时，每次加样一共可以连续点样42张载玻片，实际消耗6.7 nl样品，最终有约99.5的样品材料在点样时被浪费掉。图4 针和环点样系统。该系统由与样品溶液表面平行的开口环和一根垂直穿过环中央的点样针组成。首先将环浸入样品溶液

34、并提起，这时环内粘附上样品溶液。点样时，驱动点样针穿过环中央使得针端面上带上样品；然后针的位置持续下降直到其末端悬挂的液滴与支持物表面接触。最后将针提升，在重力和表面张力的共同作用下，部分样品转移到支持物表面，完成点样过程。（Flowers P, Overbeck J, Mace ML Jr, Pagliughi FM, Eggers WJE, Yonkers H, Honkanen P, Montagu J, Rose SD. Development and Performance of a Novel Microarraying System Based on Surface Tensio

35、n Forces. Available: resources/html/coldspring.html）分叉点样针分叉点样针，也称为鹅毛笔针，如图5中所示。这类点样针形状与古老的书写鹅毛笔类似，只是在尺寸上要小得多。分叉点样针的末端通过微加工的方法形成一道狭窄的沟槽，宽度15-50微米，每次加样量在0.1-0.5微升，通过点样针末端与点样支持物表面的轻敲，可以连续点样数百个样点，其中每个样点中转移的点样材料为纳升到皮升量级，取决于轻敲的力量、狭缝的尺寸、点样材料的粘度等参数。这种点样针的优点在于每次给点样针加样后可以连续点样大量的样点，而不需要反复加样，得到的样点在形状一致性上也较好。分叉点样

36、针在使用时通过点样针远端的弹簧固定在点样头中，点样时点样针的轻敲动作可能会造成点样支持物表面脆弱的化学修饰层、乃至点样支持物表面的损伤，或者是点样针本身或点样支持物表面某些反应性结合基团被去除，导致各个样点之间点样材料的非均一性沉积和点样材料与支持物之间结合强度的差异。对点样针更严重的损伤来自于点样针在点样头中的不正确安装，使得点样针在垂直方向上的定位出现偏差，这时的点样操作会使得点样针和支持物表面损伤和无法继续点样，如果点样针的针体弯曲严重，还会影响到其附近的其他点样针正常工作。为此，一些接触点样用的点样针在其安装末端设计有定位装置，以辅助在点样头中的安装。图5 分叉点样针。一些分叉点样针末

37、端的沟槽形状可以通过一侧向的螺钉进行调节。点样时针尖需要轻敲支持物表面，使液体转移到支持物上，这也使得针的耐久性下降。日立公司在其SPBIOTM Microarray Station中使用了一种具有特殊结构的点样针。这种点样针末端的中央区域有一个截面为X型的沟槽，向内凹陷并深入到针体内部作为样品池。由于X型沟槽是密闭在针体内的，因此可以很好地防止样品溶液的蒸发，点样制备的样点形状也得到了很好的控制。使用这种点样针每次点样时分配的样品材料体积和所得到样点的形状尺寸的变异系数为17%，并且点样材料的浪费不超过20。Stealth点样针由TeleChem公司开发的Stealth点样技术，使用平头的、

38、具有固定体积样品池的高精度点样针进行接触点样。这种Stealth点样针在结构上与分叉点样针很接近，是迄今为止使用最为广泛的点样针。该公司研发了一系列不同规格的Stealth点样针，通过微加工工艺和抛光工艺制造，分别具有不同的针头尺寸和样品池体积，使得用户可以根据需要选择特定的阵列样点尺寸和样品池体积，见图6中。点样时，每次转移的点样材料体积和样点尺寸的变异系数大约为12（12根针点样的结果）。虽然这种具有样品池结构的点样针在一次加样后可以连续点样多达160个以上的样点，但是仍有大量（大于70）点样材料被浪费掉，而且为了保证能给点样针正确加样，加样板中必须装有过量的点样材料。在正式开始点样前，这

39、种点样针要求进行预点样，以去除针头上粘附的过多点样材料，同时避免起初数个均一性不好的样点对所制备阵列芯片质量的影响，这种现象有时也称为“最初样点效应（first spot effects）”。此外，点样时的环境湿度，以及点样材料本身的浓度等参数对点样材料的转移都有影响。使用Stealth点样针制备的阵列，样点之间点样材料含量的变化较大。图6 Stealth点样针。A 点样针外观；B 点样针局部放大； C 图中上部给出了3种不同型号的点样针，型号依次为SMP3，SMP3B和SMP3XB，每次加样可以分别吸取0.25 µl, 0.60 µl 和 1.25 µl点样材料

40、，图中标尺为200 µm。图中下方是每种点样针每次加样后可以点样的样点大小和数量，所用的点样材料为浓度500 fmol/µl的Cy3标记的寡核苷酸探针溶液，溶解于1X Micro Spotting Solution (MSS)点样液，点样支持物为SuperAldehyde玻片，点样温度18°C，湿度为50%，样点间距150 µm，点样仪为PixSys 5500型。点样后使用ScanArray Express (PerkinElmer)扫描仪进行扫描。图中从左到右依次是：SMP3 可点样200个直径110 µm 样点，SMP3B可点样510 个直

41、径120 µm的样点，和SMP3XB可点样780个直径130 µm的样点，图中标尺为450 µm。毛细管点样针在接触点样技术研究的早期，Genometrix公司研制了一种毛细管点样针。这种点样针由内径极细的毛细管构成，毛细管的远端与装载点样材料的多孔板中的板孔直接相连通，每次点样时转移点样材料的体积为纳升量级。由于使用多孔板作为样品池，这种设计缓解了分叉点样针中所存在的样品溶液蒸发问题。然而在加样和点样过程中，点样针的密闭毛细管结构对毛细管内气泡的形成非常敏感。气泡的存在会导致操作过程中对毛细管内液体的流体静压力控制变得困难，这直接影响到给点样针加样和点样过程，造

42、成在点样中阵列支持物上样点没有被点上的“空点”现象，或者是向一个样点上转移过多的点样材料，造成样点变大，并有可能扩展到邻近的样点。另一种类似的毛细管点样针由Vysis公司研制，用于为该公司的Genosensor System仪器制备DNA芯片。该毛细管点样针使用了内径为25-75微米的、短的不锈钢针，在点样针的一侧末端带有一个塑料的样品池，用于贮存点样用的DNA材料，毛细管与高精度的气压系统相连接。点样时毛细管快速下降，停留在距离点样支持物表面20到50微米的高度上，此时由于惯性作用毛细管内液体在点样针的尖端形成液滴，体积约为300皮升。尽管点样针与点样支持物之间不发生直接接触，这时一个施加在

43、毛细管上的、持续时间在毫秒数量级的气压脉冲将该液滴挤出到点样支持物表面，实现点样操作。这种点样针的优点在于点样时不需要点样针直接接触点样支持物，因而不会造成对点样支持物表面的损伤。与点样针相连通的样品池也提供了足够的点样材料，一次加样后可以使用相同材料点样足够多的样点，并且可以有效防止点样材料的蒸发，允许在各轮点样的间隔期对点样针进行保存。然而，这种点样针的一个缺点是由于每次只能使用一根该毛细管点样针进行点样，并且在更换点样针后需要对针头的定位进行精确的重新校准，因而只适合于制备包含数百个样点的较小阵列。微加工毛细管点样针和鹅毛笔针通过微加工技术，可以制备内径更小的毛细管点样针，这时通过表面张

44、力的差异使得点样材料在微毛细管内移动。这种微加工毛细管点样针可以点样直径16±3微米的样点，这一尺寸要比常用的点样针小一个数量级。Oxford Laser研制的MicroSpot点样针采用金属钨为材料，通过激光切割在针体上制作宽度为5微米的狭缝，每次加样的体积为55纳升，点样时转移的样品材料体积为50皮升。可以将这种点样针制作成以阵列方式排列的，包含10K个针尖的点样工具，应用这种工具在一张标准的载玻片上可以点样100000个样点。Parallel Synthesis Technologies使用硅材料，通过微加工技术，制作了一种分叉点样针，见图7。由于硅比金属的硬度高，因此硅材料制

45、作的点样针更加耐磨，有很高的点样精度和重复性。图7 使用微加工技术制作的分叉点样针。上图，阵列针尖的扫描电镜照片，针尖区域大约为200´ 200 mm；下图，包含有48根微加工点样针的点样头。高并行度光纤状毛细管点样工具GenoSpectra研发了一种新型的点样技术，称为FiberPrint，可以将液体样品以很高的并行度转移到平整的支持物表面。一台全自动的FiberPrint系统，可以在载玻片上点样10368种可以独立寻址的DNA样品材料，每个样点可以重复3次，这样在一张玻片上可以点样30000多个样点。如图8该系统中采用了一种特殊的点样头，其中包含10000多根光纤状的毛细管，这些

46、毛细管集束在一起，形成一个平整的点样头表面。用于点样的DNA或蛋白质等生物材料临时存放在多孔板中，并放置在加压舱内。点样头的一端较大，可以和存放样品的多孔板上板孔相匹配；另一端被拉制成细圆锥形，用于点样。加样过程通过加压舱与舱外环境的压力差，使得点样材料从多孔板的板孔进入到点样头中的毛细管内。点样时每个样点上转移的材料量约为400皮升，而且就整个点样头中所有毛细管而言，变异系数在9左右。图8 FiberPrint点样系统示意图。一次性点样针VP-Scientific研制了一种使用聚丙烯为材料的、一次性使用的预成形点样针阵列，阵列中包含的点样针数目为96、384或1536，每根点样针点样时转移的

47、样品材料体积为120-135纳升，变异系数为8-12%。可以通过适配器将这种点样针阵列安装到多种点样仪设备的点样头上，每次加样时可以将存放样品材料的多孔板中所有样品一次性地加样到点样针阵列的每根点样针上。由于不需要清洗点样针以备反复使用，因此消除了为点样针更换点样材料时先前残留的材料可能会被带入新一轮点样过程而造成交叉污染的问题。不仅如此，该公司可以提供适合于多种不同型号点样仪的点样针阵列适配器，这就提高了这种预成形点样针阵列在使用上的通用性。蘸水笔纳米图案制备技术蘸水笔纳米图案制备技术（dip-pen nanolithography，DPN）技术是基于扫描探针显微术的表面纳米结构制备技术，其

48、基本原理简图9。它利用原子力显微镜的针尖将生物分子转移到支持物表面，并排列成纳米尺度的特定图案结构。它和下面要介绍的微接触印刷技术都是当前制作纳米微阵列芯片的重要技术手段。图9蘸水笔纳米图案制备技术示意图。微接触印刷技术微接触印刷（microcontact printing, mCP）技术是利用具有微纳米图案的、较软的高分子材料作为印章，把附着于其上的目标物质转移到支持物上，从而得到与印章上微纳米图案类似的目标结构。除了上面介绍的各种类型点样针以外，目前还有许多研究正致力于新型材料或设计的点样针的开发，所有这些努力，必将促进点样针技术的发展和点样微阵列芯片制备技术的日臻成熟。五、 点样过程的质

49、量控制点样仪系统的优化新的点样仪在开始使用前，整个系统必须进行正确的调整，以获取最佳点样结果。首先在安装新的点样仪设备时，要使用气泡式水平仪检查安放机械手装置的系统板的水平度，并通过调节点样仪支撑脚的高度、或者是在支撑脚下面添加必要垫片的方式进行校准。在完成对整个机械手装置系统板的水平调节后，紧接着要调整水平的是点样台，如果有必要，仍然需要通过添加垫片的方式进行调节。下面，需要对机械手装置中X和Y轴的共面性进行调整。最好使用带底座的千分表，分别与待测试的X或Y轴相连接，如图10中所示。可以首先调节底座的位置，使得千分表固定在机械手一个运动轴上与点样台接触后，指示的读数在500微米附近；然后关闭

50、点样仪的电源，手工推动该运动轴使得千分表沿着点样台或是其他平面移动，通过观察千分表的读数发现可能存在的机械手X或Y轴的水平误差。这一步骤要分别在X和Y轴的不同位置上进行多次重复测量，直至覆盖X和Y轴在点样台上的全部行程范围，这时千分表所指示的读数必须满足随机偏差最小和最大偏差不超过500微米。如果实际测量结果达不到标准，必须对机械手X或Y轴进行调整，或添加垫片。当然，这里给出的数值都是典型值，针对不同的点样仪系统，需要根据实际情况进行相应的调整。比如，机械手X或Y轴的行程越短，这一偏差值应该越小。同时，所容许的测量偏差值也受到测量时的参考平面，如点样台自身水平度的影响。图10使用千分表检查机械

51、手装置中X和Y轴的共面性。上述工作完成后，接着需要调整的是点样头的安装，调整的方式也类似。这时，需要将千分表座固定在点样台上，分别移动机械手X或Y轴的同时对点样头底部的边沿进行测量。由于点样头的长度要比X或Y轴短得多，因此所容许的偏差应该不超过100微米。如果这一标准不满足，必须对点样头进行调整或者是加垫片。在完成对点样仪系统的机械调整和校验后，有时需要将点样台表面起伏的情况全部测量和记录下来，这样在正式开始点样时，就可以利用预先测量得到的点样台表面高度偏差值，对点样仪Z轴的参数进行优化。这一工作可以通过手工的方式来完成，这时只要通过点样仪的控制软件逐步移动点样头，并记录下X和Y轴坐标，以及该

52、位置所对应的千分表读数；或者也可以通过点样仪上装配的合适位置传感器和对应软件来自动完成。如果为点样仪安装新的点样头，必须对点样仪系统进行重新调整和校准，使得点样、加样、点样针的清洁和干燥位置适合于调整后的点样头。点样时，点样头在高度设定上应该使得所有点样针的尖端与支持物表面接触，并在Z轴方向上有一个小的过行程，以确保在点样过程中所有点样针均可以和支持物表面接触而不会发生“空点”的现象。大多数点样仪中，过行程一般设定为25-100微米。如果已经对点样台的表面高度起伏进行测量并保存了这些数据，那么只要对一个位置上的过行程进行设定就可以了。加样位置的调整要使得用于加样的多孔板的中心位置与点样针对应，

53、点样针深入多孔板的深度应该设定在距离多孔板底部100微米，这样既可以避免点样针接触多孔板底部发生损伤，又能够充分利用点样材料。点样针清洗位置的调整应该使得点样针的针尖在清洗池中的浸入位置要比它在加样板中加样时的浸入位置深一些，这样可以保证针尖区域得到充分的清洁。在一些点样仪所配置的超声清洗装置中，清洗效率依赖于浸入的深度，这时必须根据经验进行合适的调整以保证针尖的浸入深度最佳。需要注意的是，处在某些浸入深度上时，超声清洗时针尖会发生共振现象，应该注意避免这类情形的发生。此外，针尖干燥位置的选择也应该根据经验来确定，使得清洗后的点样针在最短时间内得到完全的干燥。与点样过程有关问题不正常的点样过程

54、常常表现为样点尺寸变化较大、偏离点样针标称的直径，和出现“漏点”。造成这些现象的原因可能来自四个方面，即机械手装置、点样针、点样材料，以及点样的环境因素。机械手装置与机械手装置有关的错误通常是可重复性的，在点样仪的工作中会反复出现。例如，在点样台的同一位置上，偏离点样针标称直径的样点重复出现，这时可能就需要对该位置处点样针的高度进行调整。如果点样头一侧所点样的样点尺寸与另一侧相比总是变化较大，这时就可能需要对点样头的水平度进行调节。有时由于点样针干燥装置的机械位置出现误差，会使得点样头中少数或个别点样针上仍有水迹残留，这些点样针对应的支持物表面会产生“漏点”现象。如果在更换点样材料的各轮点样操

55、作之间，点样针的干燥程度不同，这会导致随机性的“漏点”现象。点样针点样针问题也通常也表现为系统性的偏差，例如点样头中特定位置上点样针的点样行为总是不正常。查找这种类型错误时，一个有效的方法是更换点样针的位置重新将点样针在点样头中排列，然后确定错误总是与点样头上特定的位置对应，还是总是伴随某根特定的点样针。在点样头中，有时会发生点样针粘滞在固定套管中而无法自由活动的情况，这时在点样操作完成后点样针无法返回到初始的位置上，带来的影响是在下次点样时点样针可能无法与支持物表面发生接触，或是点样针无法继续加样，或是点样针的清洗和干燥不正常。对点样针及它在点样头中对应的安装位置进行清洁通常可以解决这一问题

56、。点样时隶属于某根特定点样针的样点尺寸发生变化，常常是由于该点样针的磨损所引起的，这在金属材料制作的点样针中是较为常见的问题。如果点样针的尖端在使用中被磨平，那么常常引起样点尺寸的增大；如果毛细管点样针的开口被堵塞，则会使得点样的样点尺寸变小。陶瓷或者硅材料制作的点样针由于材料的质地较硬，因此不容易受到这类问题的影响。如果点样针被疏水性材料，如点样仪中润滑机械部件的硅润滑剂污染，那么通常会造成该点样针完全停止点样。点样材料点样得到的样点尺寸与加样板中点样材料在浓度和体积上的一致性，以及选择合适点样缓冲液之间有着密切的关系。当加样板某些孔中点样材料的浓度过低时，点样得到的样点会有较大的变化。使用

57、来自同一块加样板中的点样材料进行重复点样时，很容易发现这类问题。同时，对装载点样材料的多孔板也要进行挑选，选取那些平整的多孔板，以确保点样头上所有点样针都能够得到正确加样。点样用的支持物可以使用自制的、或者是购买的商品，但是都必须要具有均一性的包被，以获得最佳的点样特性。可以使用标准的DNA材料，如鲱鱼精DNA进行点样来评价支持物包被是否符合点样的要求。包被质量较差的支持物表面，其上点样得到的样点通常表现为大小与标称值不符，并且这些例外样点的出现是随机性的，与点样针位置、特定点样材料，或者是机械手装置移动的特定位置无关。一般而言，支持物表面所修饰的包被有一定的使用时间限制，不要使用超过保存期的

58、支持物点样。在使用聚赖氨酸包被的玻片作为支持物时，点样用的DNA一般悬浮于3´SSC（sod ium chloride and sodium citrate，氯化钠和柠檬酸钠）缓冲液中。但是，许多研究人员也使用50的二甲亚砜缓冲液，因为有报道这种缓冲液可以使DNA变性，从而有利于芯片上的分子杂交反应，并且这种缓冲液的蒸发速率要比SSC低，因而在点样时可以将点样材料长时间保存在开口的多孔板中，从而适合于点样过程时间较长的场合。此外，许多商品化的点样支持物同时也提供了专用的点样缓冲液。点样环境正如前面提到的那样，点样时的温度和湿度对所制备点样微阵列芯片的质量有很大影响。较高的环境温度和较低的湿度将使得点样材料在点样针上发生过早的干燥，从而使得样点的质量逐渐变差。点样过程的质控方法关于点样微阵列芯片制备过程中质量